二级细胞悬浮培养法生产紫草素实验研究
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【摘要】运用二级细胞悬浮培养法进行了新疆紫草的细胞培养生产紫草素的实验，通过测定，紫草宁的平均产率为0.053g/g干重细胞。
【关键词】新疆紫草；二级细胞悬浮培养法；紫草素
新疆紫草(Arnebia euchr0ma(Royle) Johnst.)为紫草科多年生草本植物紫草和新疆紫草或内蒙紫草的根。味甘，性寒。归心、肝经。功效凉血活血，解毒透疹。主治热病斑疹、麻疹不透、腮腺炎、尿路感染、便秘、肝炎、吐血、尿血等症，外用治疗阴道炎、阴部瘙痒、水火烫伤、冻伤、湿疹以及痈疽疮痈等症。现代医学研究与临床证明，紫草含乙酰紫草醌、紫草醌等，对心脏有兴奋和抑制作用；有缓和的解热作用；对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、流感病毒等病原微生物有抑制作用；有避孕作用；还有抗炎作用；对绒毛膜上皮癌及恶性葡萄胎有一定治疗作用。紫草宁及其衍生物作为紫草的有效成分,国内外许多研究者通过细胞培养法生产紫草宁作了研究，取得了一定的成果。本实验通过二级细胞悬浮培养法进行了紫草的细胞培养生产紫草素的进一步探索。
1实验原理
紫草的成熟种子在一定条件下诱发形成根部愈伤组织，通过建立细胞系并进行高产细胞系的筛选和培养，采用“两级培养法”进行培养(细胞增殖培养和生产紫草素的培养)，并测定紫草素含量。
2实验流程
紫草种子活力检验→紫草愈伤组织的诱导→目视筛选获取优良细胞株→细胞悬浮培养(二级培养法)→产物测定。
3培养方法及步骤
3.1紫草种子活力检验
紫草种子活力检验用发芽试验法来测定，以确定师傅作为试验的种源。
3.2愈伤组织形成和优良细胞株获取
3.2.1愈伤组织的诱导用新疆紫草种子将紫草成熟种子置于含有 10-6 mol/L2,4-D和10-6 mol/L激动素的LS琼脂培养基上，在黑暗条件下25℃培养。种子萌发后于幼根部形成愈伤组织，用目视筛选的方法从亲本植物愈伤组织中获取优良细胞株，采用此种优良细胞株作为细胞液体悬浮培养的材料。
3.2.2细胞系的建立将所得到的春节那个细胞群以一定的密度接种在1mm厚度的薄层固体培养基上，进行平板培养，使之形成细胞团，尽可能是每个细胞团均来自一个单细胞，采用显微镜观察细胞的颜色，初步筛选出色素含量高的细胞系。
3.2.3高产细胞系的扩大培养将高产细胞装入含有10-6mol/L LAA和10-6 mol/L激动素LS液体培养基在25℃下进行黑暗培养，转速为100r/min,对培养物进行色素鉴定，多次重复鉴定确定细胞的稳定性。
3.2.4继代培养将高产细胞转装入80ml含有10-6mol/L LAA和10-6mol/L激动素LS液体培养基的300ml三角杯中，在100r/min 速转震荡培养，使细胞增殖。瓶塞用市售通气很好的不锈钢盖。培养初期由于琼脂培养细胞产生的紫草素易变质，细胞外观极不均一，但经过14d培养的细胞移入新鲜的培养基后，迅速产生白色的细胞大量增殖，以后每隔14d移入新鲜培养基，即可获得均一的细胞团。这种均一的细胞经14培养约增加13倍。细胞移植时，用不锈钢制孔径40µm的筛网，收集细胞按80ml培养基加1.5g鲜重的比例进行接种。
3.3细胞液体悬浮培养
采用两级细胞悬浮培养法进行,第一阶段培养以增殖细胞为目的的培养基上培养，然后将获得的种细胞在第二阶段进行生产紫草素为目的的培养基上培养。分别采用MG-5和M-9培养基(山田康之等设计)，见下表
第一阶段为细胞迅速增殖阶段。将接种在LS培养基内继代培养14d后，用继代培养所述的方法收集细胞，将1.5g鲜重细胞接种在80ml MG-5培养基中，进行振荡培养，在细胞增加6～7倍后，自第10～11天起对数增殖期结束，增殖速度开始降低。 在第一阶段培养主要是细胞的迅速增殖，紫草素含量较低。
第二阶段紫草素的合成和累积阶段。以上述方法收集第一阶段所获得的细胞，将2.4g鲜重细胞移入装有80ml M-9培养基的300ml三角瓶中，在100r/min转速下震荡培养。紫草素的生成能为肉眼所确定。从培养第二天，一部分细胞即呈红色，至第7天全部细胞团完全呈鲜红色，经14d培养，并测定细胞中紫草素含量。M-9培养基进行第二阶段的培养，细胞增殖率较低,此期主要是紫草素的合成和累积。
第一阶段培和第二阶段培养都采用300ml 三角烧瓶养置于转速为80r/min的摇床上，在25-26℃黑暗条件下进行振荡培养。培养周期分别为11天和14 天。
4培养结果
通过测定，细胞的紫草宁的平均产率为0.053g/g干重细胞。实验结果与国内相关研究结果相一致。由此可以看出，二级细胞悬浮培养法细胞的紫草宁产率远高于天然植物 ......
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