归藤活血壮骨胶囊的制备及应用
【摘要】目的归藤活血壮骨胶囊来源于临床经验方，由续断、当归、鸡血藤、赤芍、桃仁、红花、川芎、地黄、泽兰、姜黄、骨碎补等药组成，具有活血消肿，接骨续筋的功效，用于治疗骨折及伤筋早期骨断筋伤、瘀血内阻之症。本研究为该方药制定了制剂的质量标准。方法采用薄层色谱法对方中各药进行定性鉴别，按药典要求对该制剂进行检查，并建立HPLC法测定制剂中川续断皂苷Ⅵ含量的方法，制定制剂中川续断皂苷Ⅵ的含量限度。结果建立的TLC法对诸药定性检测和HPLC法对川续断皂苷Ⅵ含量测定的质量标准方便可靠。本研究提供了有价值的实验数据。经临床50例病人疗效观察，有效率达96%。
【关键词】归藤活血壮骨胶囊；薄层色谱；高效液相色谱法；质量标准
归藤活血壮骨胶囊是我院经过十余年的临床实践，结合现代医学对骨伤的研究分析，逐步整理完善而形成的有效方剂。该方以中医基础理论为指导，以辩证论治为基础，以中药相关配伍为原则，结合现代药理研究整合而成。该方由续断、当归、鸡血藤、赤芍、桃仁、红花、川芎、地黄、泽兰、姜黄、骨碎补等中药组成的，为硬胶囊，内容物为棕色至棕褐色颗粒；味微苦。为保证用药的安全有效，须对其质量进行严格控制，严格按照处方及工艺要求生产。本实验研究了归藤活血壮骨胶囊中各味药材的薄层色谱鉴别方法；制定了制剂的重要组成药味续断的高效液相含量测定方法。经临床多年观察疗效确切值得推广。
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1材料
1.1仪器设备
Agilent1200高效液相色谱仪(美国安捷伦(Agilent)科技公司，G1314B紫外检测器)、依利特C18高效液相色谱柱(250mm×4.6mm, 5µm)、JA5003N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)、BT125D型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)、RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、超声波清洗器(天津市恒奥科技发展有限公司)
点样用定量毛细管、双槽展开缸、玻璃喷雾瓶、三用紫外仪
硅胶G薄层色谱板(青岛海洋化工厂)
1.2试剂试药
归藤活血壮骨胶囊样品(自制，批号：090309、090310、090311)。
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川续断皂苷Ⅵ对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号111685-200401)、芍药苷对照品(批号：110736-200629)、苦杏仁苷对照品(批号：820-200002)、红花对照药材(批号：120907-200609)、川芎对照药材(批号：120918-200608)，续断药材(购自聊城市利民药业有限公司)、乙腈(色谱纯，美国Fisher试剂公司)均购自中国药品生物制品检定所。
所用其他化学试剂均为分析纯。
2制备工艺
2.1处方 续断 当归鸡血藤 赤芍 红花 地黄 桃仁 泽兰 川芎 姜黄骨碎补
2.2制法取以上11味中药加水煎煮二次，第一次加10倍量水煎煮2小时，第二次加8倍量水煎煮1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至流浸膏，提取物中加入1倍量糊精，以适量95%乙醇为润湿剂，制成软材，过22目筛进行制粒，将湿颗粒于70℃干燥30min，取出整粒，填充胶囊。
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3质量控制
3.1性状 本品为胶囊剂，内容物为黄棕色至棕褐色的粉末；气微香。
3.2鉴别
3.2.1取本品内容物6g，加乙醇20ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40：5：10：0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。[1]
3.2.2取本品内容物2g，研细，加乙醇10ml，超声处理20min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取苦杏仁苷对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(2005版药典一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各5µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-乙醇(2∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。[2]
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3.2.3取本品内容物3g，加80%丙酮溶液10ml，密塞，超声处理10分钟，滤过， 滤液作为供试品溶液。另取红花对照药材0.5g，加80%丙酮溶液5ml，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(2000版药典一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述二种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7：2：3：0.4)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。[3]
3.2.4取本品内容物4g，研细，加乙醚20ml，超声处理20min，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取川芎对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(2005版药典一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各5µl，分别点于同一硅胶G板上，以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。[4]
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3.3含量测定
续断系归藤活血壮骨胶囊中的主药，续断的主要成分为川续断皂苷Ⅵ，且有标准对照品，因此归藤活血壮骨胶囊的含量测定以测定川续断皂苷Ⅵ的含量为定量指标较为合理。其方法为：以川续断皂苷Ⅵ为对照品，以归藤活血壮骨胶囊为供试品，另取缺续断的空白阴性制剂，同法制成空白阴性溶液。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20µl注入液相色谱仪，测定，即得。[5]
精密度试验精密吸取胶囊内容物溶液连续进样6次，测得川续断皂苷Ⅵ的峰面积积分值，计算得川续断皂苷Ⅵ峰面积RSD值为1.63%。结果表明精密度良好。
稳定性试验同一供试品溶液10h内每隔2h进样测定一次，测得川续断皂苷Ⅵ的峰面积积分值，川续断皂苷Ⅵ峰面积RSD值为1.92%。结果表明样品液在10h内稳定性良好。
重复性试验取同种待测胶囊内容物粉末制备供试溶液，平行操作6份，测定川续断皂苷Ⅵ峰面积，计算其校正值，川续断皂苷Ⅵ校正峰面积RSD值为2.49%。结果表明重复性良好。
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加样回收率测定采用加样回收法。取已知含量的胶囊内容物粉末5份，精密称定，每份约0.55g，分别加入川续断皂苷Ⅵ对照品溶液适量，制备供试溶液，测川续断皂苷Ⅵ含量，计算加样回收率，平均为97.8%，5份药品RSD为2.57%。结果表明本实验回收率良好。
阴性对照试验 取缺续断的阴性制剂依法制备供试品溶液，进样，阴性对照对川续断皂苷Ⅵ测定没有影响。
样品测定
取归藤活血壮骨胶囊三批，分别按上文所述方法条件操作，以外标法计算川续断皂苷Ⅵ含量。三批样品测定结果基本一致，将该三批样品结果的平均值下降20%，暂定本品每粒含续断以川续断皂苷Ⅵ(C47H76O18)计，不得少于120mg。
结果表明：该含量测定方法可以准确，简便、快速测定出归藤活血壮骨胶囊中川续断皂苷Ⅵ的含量，是控制该制剂主要有效成分含量的较好的方法。
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4临床观察
4.1病例选择：
归藤活血壮骨胶囊主要选用活血，消肿止痛，壮骨续筋等中药有机组方而成。适用于骨折，伤筋后局部肿胀疼痛，皮肤青紫，功能受限，面色萎黄，舌质紫暗或有瘀斑，脉细弦或涩等瘀血内阻之证的患者。本组总结病例50例，男39例，女11例。年龄11-67岁。
4.2用药方法：归藤活血壮骨胶囊内服，4粒/次，3次/日，每15天为一疗程。
4.3观察指标
患者局部症状，肿胀及疼痛的变化。
4.4疗效评价
显效：半月内局部肿胀，疼痛等症状完全消失。
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有效：半月内局部肿胀，疼痛等症状明显减轻。
无效：半月内局部肿胀，疼痛等症状无改善。
4.5结果
50例中显效48例，占96%；有效1例占2%；无效1例占2%。
5讨论
本实验中赤芍等药材的TCL鉴别试验显示，阴性无干扰，方法具有专属性。制剂中续断为主药，其主要活性成分为川续断皂苷Ⅵ，故选定为定量测定指标。HPLC检测方法简便，灵敏度高，重复性好，可作为本品的质量控制标准。
制剂中所用续断药材川续断皂苷Ⅵ含量为2.30%，符合中国药典2005年版不小于2.0%的规定，成品中川续断皂苷Ⅵ的转移率约为91.5%，在生产制备过程中损失较小。因此该制剂的制备工艺比较合理。
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经临床50例疗效观察，总有效率达96%；显示临床疗效确切，值得推广。
参考文献
[1]中国药典，一部[S]2005：28；64.
[2]尤献民，邹桂欣，张彗影.乳康平颗粒剂中赤芍、当归及黄芪的薄层鉴别[J]时珍国医国药，1997,04: 52.
[3] 次旦扎西 ，刘松青，林彩.脑伤泰颗粒剂中红花和桃仁的薄层色谱鉴别[J]中国药业，2003,12(9)：43.
[4]赵丽恋，夏新华，川芎醇提工艺研究，中成药，2002，24(3)：173～174.
[5]谭洪根，林生.高效液相色谱法测定续断药材中川续断皂苷Ⅵ的含量[J]，中国中药杂志，2006，31(9)：727., 百拇医药(任连堂)
【关键词】归藤活血壮骨胶囊；薄层色谱；高效液相色谱法；质量标准
归藤活血壮骨胶囊是我院经过十余年的临床实践，结合现代医学对骨伤的研究分析，逐步整理完善而形成的有效方剂。该方以中医基础理论为指导，以辩证论治为基础，以中药相关配伍为原则，结合现代药理研究整合而成。该方由续断、当归、鸡血藤、赤芍、桃仁、红花、川芎、地黄、泽兰、姜黄、骨碎补等中药组成的，为硬胶囊，内容物为棕色至棕褐色颗粒；味微苦。为保证用药的安全有效，须对其质量进行严格控制，严格按照处方及工艺要求生产。本实验研究了归藤活血壮骨胶囊中各味药材的薄层色谱鉴别方法；制定了制剂的重要组成药味续断的高效液相含量测定方法。经临床多年观察疗效确切值得推广。
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1材料
1.1仪器设备
Agilent1200高效液相色谱仪(美国安捷伦(Agilent)科技公司，G1314B紫外检测器)、依利特C18高效液相色谱柱(250mm×4.6mm, 5µm)、JA5003N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)、BT125D型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)、RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、超声波清洗器(天津市恒奥科技发展有限公司)
点样用定量毛细管、双槽展开缸、玻璃喷雾瓶、三用紫外仪
硅胶G薄层色谱板(青岛海洋化工厂)
1.2试剂试药
归藤活血壮骨胶囊样品(自制，批号：090309、090310、090311)。
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川续断皂苷Ⅵ对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号111685-200401)、芍药苷对照品(批号：110736-200629)、苦杏仁苷对照品(批号：820-200002)、红花对照药材(批号：120907-200609)、川芎对照药材(批号：120918-200608)，续断药材(购自聊城市利民药业有限公司)、乙腈(色谱纯，美国Fisher试剂公司)均购自中国药品生物制品检定所。
所用其他化学试剂均为分析纯。
2制备工艺
2.1处方 续断 当归鸡血藤 赤芍 红花 地黄 桃仁 泽兰 川芎 姜黄骨碎补
2.2制法取以上11味中药加水煎煮二次，第一次加10倍量水煎煮2小时，第二次加8倍量水煎煮1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至流浸膏，提取物中加入1倍量糊精，以适量95%乙醇为润湿剂，制成软材，过22目筛进行制粒，将湿颗粒于70℃干燥30min，取出整粒，填充胶囊。
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3质量控制
3.1性状 本品为胶囊剂，内容物为黄棕色至棕褐色的粉末；气微香。
3.2鉴别
3.2.1取本品内容物6g，加乙醇20ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40：5：10：0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。[1]
3.2.2取本品内容物2g，研细，加乙醇10ml，超声处理20min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取苦杏仁苷对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(2005版药典一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各5µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-乙醇(2∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。[2]
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3.2.3取本品内容物3g，加80%丙酮溶液10ml，密塞，超声处理10分钟，滤过， 滤液作为供试品溶液。另取红花对照药材0.5g，加80%丙酮溶液5ml，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(2000版药典一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述二种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7：2：3：0.4)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。[3]
3.2.4取本品内容物4g，研细，加乙醚20ml，超声处理20min，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取川芎对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(2005版药典一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各5µl，分别点于同一硅胶G板上，以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。[4]
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3.3含量测定
续断系归藤活血壮骨胶囊中的主药，续断的主要成分为川续断皂苷Ⅵ，且有标准对照品，因此归藤活血壮骨胶囊的含量测定以测定川续断皂苷Ⅵ的含量为定量指标较为合理。其方法为：以川续断皂苷Ⅵ为对照品，以归藤活血壮骨胶囊为供试品，另取缺续断的空白阴性制剂，同法制成空白阴性溶液。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20µl注入液相色谱仪，测定，即得。[5]
精密度试验精密吸取胶囊内容物溶液连续进样6次，测得川续断皂苷Ⅵ的峰面积积分值，计算得川续断皂苷Ⅵ峰面积RSD值为1.63%。结果表明精密度良好。
稳定性试验同一供试品溶液10h内每隔2h进样测定一次，测得川续断皂苷Ⅵ的峰面积积分值，川续断皂苷Ⅵ峰面积RSD值为1.92%。结果表明样品液在10h内稳定性良好。
重复性试验取同种待测胶囊内容物粉末制备供试溶液，平行操作6份，测定川续断皂苷Ⅵ峰面积，计算其校正值，川续断皂苷Ⅵ校正峰面积RSD值为2.49%。结果表明重复性良好。
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加样回收率测定采用加样回收法。取已知含量的胶囊内容物粉末5份，精密称定，每份约0.55g，分别加入川续断皂苷Ⅵ对照品溶液适量，制备供试溶液，测川续断皂苷Ⅵ含量，计算加样回收率，平均为97.8%，5份药品RSD为2.57%。结果表明本实验回收率良好。
阴性对照试验 取缺续断的阴性制剂依法制备供试品溶液，进样，阴性对照对川续断皂苷Ⅵ测定没有影响。
样品测定
取归藤活血壮骨胶囊三批，分别按上文所述方法条件操作，以外标法计算川续断皂苷Ⅵ含量。三批样品测定结果基本一致，将该三批样品结果的平均值下降20%，暂定本品每粒含续断以川续断皂苷Ⅵ(C47H76O18)计，不得少于120mg。
结果表明：该含量测定方法可以准确，简便、快速测定出归藤活血壮骨胶囊中川续断皂苷Ⅵ的含量，是控制该制剂主要有效成分含量的较好的方法。
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4临床观察
4.1病例选择：
归藤活血壮骨胶囊主要选用活血，消肿止痛，壮骨续筋等中药有机组方而成。适用于骨折，伤筋后局部肿胀疼痛，皮肤青紫，功能受限，面色萎黄，舌质紫暗或有瘀斑，脉细弦或涩等瘀血内阻之证的患者。本组总结病例50例，男39例，女11例。年龄11-67岁。
4.2用药方法：归藤活血壮骨胶囊内服，4粒/次，3次/日，每15天为一疗程。
4.3观察指标
患者局部症状，肿胀及疼痛的变化。
4.4疗效评价
显效：半月内局部肿胀，疼痛等症状完全消失。
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有效：半月内局部肿胀，疼痛等症状明显减轻。
无效：半月内局部肿胀，疼痛等症状无改善。
4.5结果
50例中显效48例，占96%；有效1例占2%；无效1例占2%。
5讨论
本实验中赤芍等药材的TCL鉴别试验显示，阴性无干扰，方法具有专属性。制剂中续断为主药，其主要活性成分为川续断皂苷Ⅵ，故选定为定量测定指标。HPLC检测方法简便，灵敏度高，重复性好，可作为本品的质量控制标准。
制剂中所用续断药材川续断皂苷Ⅵ含量为2.30%，符合中国药典2005年版不小于2.0%的规定，成品中川续断皂苷Ⅵ的转移率约为91.5%，在生产制备过程中损失较小。因此该制剂的制备工艺比较合理。
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经临床50例疗效观察，总有效率达96%；显示临床疗效确切，值得推广。
参考文献
[1]中国药典，一部[S]2005：28；64.
[2]尤献民，邹桂欣，张彗影.乳康平颗粒剂中赤芍、当归及黄芪的薄层鉴别[J]时珍国医国药，1997,04: 52.
[3] 次旦扎西 ，刘松青，林彩.脑伤泰颗粒剂中红花和桃仁的薄层色谱鉴别[J]中国药业，2003,12(9)：43.
[4]赵丽恋，夏新华，川芎醇提工艺研究，中成药，2002，24(3)：173～174.
[5]谭洪根，林生.高效液相色谱法测定续断药材中川续断皂苷Ⅵ的含量[J]，中国中药杂志，2006，31(9)：727., 百拇医药(任连堂)