连翘叶茶提取物的抑菌活性研究
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【摘要】目的 研究连翘叶茶提取物的抑菌活性。方法 以金色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念球菌为代表菌种，用K-B纸片扩散法对连翘叶茶提取物的抑菌活性进行初步研究。结果 连翘叶不同提取物对供试菌均有一定的抑菌活性，其中乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物具有较强的抑菌活性。提取物对金色葡萄球菌的抑菌活性与提取物浓度成正比，对大肠杆菌和白色念球菌的抑菌活性与提取物浓度不成正比关系。结论连翘叶不同提取物对金色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念球菌均有抑制作用。
【关键词】连翘叶；提取物；抑菌活性
连翘为木犀科(Oleaceae)连翘属(Forsythia)植物连翘(Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl)的干燥果实。连翘药材商品分为“青翘”和“老翘”，果实初熟尚带绿色时采收称为青翘，果实熟透颜色发黄时采收称为老翘[1]。连翘是中国临床常用传统中药之一，以果实入药，连翘叶近年来制成珠茶作为滋补调理饮料发展较快，但目前对于连翘叶的研究多集中所含化学成分的研究[2]、保肝作用及其抗氧化作用[3-5]的研究。因此，我们研究连翘叶茶的抗菌作用，为其作为药材或保健品开发利用提供依据。
1 器材
1.1 药材
连翘叶2010年4月采自山西省安泽县连翘GAP生产基地，植物标本由山西省药检所郭文菊研究员鉴定，植物标本现存于山西中医学院实验中心。
1.2 试剂与菌株
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherchia coli)、白色念珠菌(Candida albicans)，均由山西省药品检验所提供。营养琼脂培养基，购自杭州天和微生物试剂有限公司；牛肉膏购自北京市海淀区微生物培养基制品厂，蛋白胨购自北京奥特博星生物技术有限责任公司，庆大霉素细菌药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司，所用试剂均为分析纯。
1.3 仪器与设备
仪器：LR4001型旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)；CA-111型冷却水循环系统(上海爱郎仪器有限公司)；SHB-88型水循环真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；DHP-9162型电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；DSX-280B型手提式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；BBS-DSC型洁净工作台(上海巴艾贝斯科技有限公司)；BS224S-L型电子分析天平(德国Sartorius公司)。
2 方法
2.1连翘叶提取物的制备
取连翘叶300 g，粉碎，用95%乙醇加热至75 ℃回流提取3次，每次1小时，减压浓缩回收溶剂至无醇味，得总提取物35 g。总提取物经水悬浮后，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，得到的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取相及萃取后水相提取。取适量各部位浸膏及总浸膏，干燥成粉末，备用。
2.2 抑菌活性分析
2.2.1药敏纸片的制备[5]
将普通定性滤纸用打孔机打成直径为6 mm的圆形纸片，经121 ℃，20 min高压灭菌，干燥。分别取干燥后的不同待试样品0.5, 1.0, 2.0 mg，用合适的溶剂溶解，将滤纸片放入溶液中，反复吸取、晾干，直至将溶液吸干，备用。
2.2.2 培养基的制备
固体培养基：用天平准确称取36 g营养琼脂，加入蒸馏水1000 ml，加热并不断搅拌，使琼脂完全溶解。然后放入压力蒸汽灭菌器中经121 ℃、20 min高压灭菌，取出趁热倒入经过高压灭菌的培养皿中，厚度约3～5 mm , 冷却凝固后备用。
液体培养基[6]：用天平准确称取牛肉膏0.3 g，蛋白胨1 g，氯化钠0.5 g，加入蒸馏水100 ml，加热并不断搅拌，用1 % NaOH溶液调节pH 7.2～7.4，然后放入压力蒸汽灭菌器中经121 ℃、20 min高压灭菌，分装于试管中，备用。
2.2.3菌悬液的制备
用接种环分别取各菌种一环，接种于液体培养基中，放入37 ℃培养箱中培养24 h，用灭菌生理盐水分别稀释至1×10-5 CFU/ml浓度，备用。
2.2.4药物抑菌作用测定
采用K-B纸片扩散法[6-7]，用无菌移液管吸取稀释好的菌悬液0.1 mL，置于培养基中央，用涂布棒涂布均匀。用无菌镊子夹取含药滤纸片贴在培养基表面，以含药量为10 μg的庆大霉素细菌药敏试纸为阳性对照。37 ℃培养24 h后，观察并测量抑菌圈直径, 结果以mm表示。每种不同含药量的样品对3种菌均做3组平行对照，结果取平均值。
3 结果与分析
3.1连翘叶提取物的抑菌作用比较
连翘叶不同提取物，以细菌大肠杆菌、金色葡萄球菌和霉菌白色念珠菌作为指示菌进行抑菌实验，结果见表1，2和3。
表1连翘叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈活性
注：“-” 表示没有明显抑菌圈
从表1看出，氯仿提取物对金黄色葡萄球菌没有抑制作用，石油醚提取物对金黄色葡萄球菌略有抑制作用。其余各提取物均对金黄色葡萄球菌均有抑制作用，其活性比较：正丁醇提取物﹥乙酸乙酯提取物﹥水提取物﹥95%乙醇提取物。并且，随着纸片含药量的增加，抗菌作用增强。
表2 连翘叶提取物对大肠杆菌的抑菌圈活性
注：“-” 表示没有明显抑菌圈。
从表2可知，连翘叶不同提取物对大肠杆菌均有一定抑制作用。但总体来看，几乎所有提取物对大肠杆菌的抑制作用均弱于对金黄色葡萄球菌的抑制作用。石油醚提取物与95%乙醇提取物在含药量为0.5 mg时抗菌活性最强，氯仿提取物在含药量为1.0 mg时抗菌活性最强，而其它提取物含药量为2.0 mg时抗菌活性最强。
表3 连翘叶提取物对白色念珠菌的抑菌圈活性
从表3可知，连翘叶不同提取物对白色念珠菌均有一定抑制作用。乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对白色念珠菌的抑制作用较强，其次为95%乙醇提取物。几乎所有提取物的抑菌作用不受含药量改变的影响。纸片含药量为0.5 mg时，显示出略强的抗菌活性，说明浓度与抑菌作用强弱之间并不成简单的正比关系。
3讨论
本研究表明：连翘叶不同提取物对三种菌株均表现了不同程度的抑菌作用，抑菌作用依次为金黄色葡萄球菌﹥大肠杆菌>白色念珠菌。研究结果可以指导连翘叶中抑菌活性成分的分离分析，以证明连翘叶在其他的药理学作用方面是否也具有与连翘果实相似的作用，是否可以作为药用值得进一步的探讨，同时连翘叶资源广泛，成本低廉，应该具有较好的开发前景。
参考文献 ......
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