尿素测定方法的概述
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【摘要】 尿素是人体内蛋白质代谢的最终产物，由肝脏合成主要通过肾脏排出。血清尿素的测定是临床上用于诊断和观察各种肾脏疾病的一项重要指标。尿素浓度处于各个不同的医学决定水平有着不同的临床意义。并且尿素的检测对慢性肾脏疾病的病程、病情观察及预后判断均有意义，但它并不是肾功能损伤的特异性指标[1]。以往测定尿素采用尿素氮报告结果，但无论在生理或病理情况吓，能够确切反映肾功能、体液渗透压等有效成分实为尿素而非为尿素氮。固现推荐统一采用尿素报告结果。换算公式为：1mmol/L尿素氮=1/2mmol/L[2]。
【关键词】 尿素;脲酶;比色法
1 标本
血清和肝素抗凝血浆在二乙酰一肟法，脲酶/GLDH，离子导电法中均可应用。氟化物能抑制脲酶反应，故不能用氟化物作为血清的抗凝剂，肝素铵抗凝剂也不能在脲酶法中使用。尿标本按照1：20到1：50稀释后，可用以上三种方法测定。由于尿素易于被细菌降解，故血清和尿样品在分析前应放置在4—8℃。
2 测定方法
血清尿素的测定是临床上用来诊断和观察各种肾脏疾病的重要生化指标，尿素的测定方法包括：氨电极法、脲酶-波氏法，脲酶-谷氨酸脱氢酶偶联法，脲酶-亮氨酸脱氢酶偶联法等等[3]
2.1 化学法
2.1.1 二乙酰一肟显色法：尿素可与二乙酰作用，在强酸加热条件下，生成粉红色的二嗪化合物，在540nm比色，因二乙酰不稳定，常用二乙酰一肟代替，后者遇酸水解成二乙酰。反应式如下：
此法专一性差，线性范围狭窄，且试剂中含有烈性化学物，易腐蚀仪器和污染环境。
2.1.2 邻苯二甲醛比色法：尿素在强酸性环境下，与邻苯二甲醛缩合产生橙红色产物，比色测定之。
2.1.3 二苯吡喃醇比浊法：尿素与二苯吡喃醇结合形成不溶性沉淀，比色测定之。[5]
采用化学法检测尿素，特异性均不高，如瓜氨酸对二乙酰反应有正干扰；甘氨酸、精氨酸、瓜氨酸及磺胺类药物对邻苯二甲醛反应有正干扰。加之要用强酸或强碱环境，或需要较高温度(90℃)反应，较难实现自动化，故这类方法已经较少使用 [5] 。
2.2 尿素酶法[4] 利用尿素酶水解尿素生成氨和CO2而测定
2.2.1 脲酶—波氏法：测定原理：首先用脲酶水解尿素，产生2分子氨和1分子二氧化碳。然后，氨在碱性介质中与苯酚及次氯酸反应，生成蓝色的吲哚酚，此过程需用亚硝基氰化钠催化反应。蓝色吲哚酚的生成量与尿素含量成正比，在630nm波长比色测定。本法亦能测定尿液中的尿素。
此法的不足在于空气中氨气对试剂或玻璃器皿的污染或使用铵盐抗凝剂可使结果偏高。高浓度氟化物可抑制尿素酶，引起结果假性偏低。
2.2.2 甲酚红脲酶测定血清尿素法：测定原理：尿素在脲酶作用下产生氨而使溶液pH升高，pH指示剂颜色发生相应变化，与同样处理的标准进行比较即可求得尿素含量 [6] 。
2.2.3 脲酶结合邻甲酚酞络合剂(OCPC)比色法测定血清尿素：脲酶水解尿素产生氨(NH3)，使溶液pH升高，以邻甲酚酞络合剂(OCPC)作为pH指示剂，波长570nm吸光度变化与尿素浓度成正相关 [7] 。
2.2.4 脲酶甲基麝香草酚蓝比色法测定尿素：脲酶水解尿素产生氨(NH3)，使溶液pH升高，pH升高的幅度与尿素含量呈线性关系，现以甲基麝香草酚蓝作为pH指示剂监测反应液pH的变化，从而推算出尿素的含量。[8]
2.2.5 1998年Naslund等报告利用尿素氨基水解酶(ATP水解酶)(EC.3.5.1.45)，使尿素和ATP水解反应：
ATP的水解率利用虫荧光素—荧光素酶反应的发光分析系统，可检测微量标本中的尿素，检测下限可达5μmmol/L，具有很高的检测灵敏度 [5] 。
2.2.6 脲酶—纳氏试剂显色法：测定原理：无蛋白滤液中的尿素，经脲酶作用后产生的氨，在碱性环境中与纳氏试剂作用，显棕黄色。
重金属离子可抑制脲酶作用，故所用试管、吸管必须十分清洁。红细胞内和血浆中的尿素含量基本一致，故全血、血清或血浆标本均可。测定与配制试剂所用蒸馏水应无氨 [9]
2.2.7 脲酶—谷氨酸脱氢酶偶联法：
测定原理：
尿素在脲酶(Urease)催化下,水解成NH3和CO2;NH3在α-酮戊二酸和还原型辅酶Ⅰ(NADH)存在下,通过谷氨酸脱氢酶(GLDH)催化生成谷氨酸,同时NADH被氧化成NAD+(氧化型辅酶Ⅰ)。前者在340nm波长处有吸收峰，氧化成NAD+后吸收峰消失。故通过在同一条件下测定空白管、标准管和测定管在340nm处吸光度的下降速率，即可计算出样品中尿素的含量 [10]。
2.2.8 亮氨酸脱氢酶(UV-LED)： 测定原理：血清和尿液中内源性氨离子与α-酮戊二酸、NADH和LED反应，NADH氧化为NAD+速率取决于内源性氨离子的量；接着加入脲酶到反应系统中，测定尿素产生的氨离子和内源性氨离子共同使NADH氧化为NAD+的速率，通过两者之差即可计算出样品中尿素的含量。
此法特点：利用脲酶和亮氨酸脱氢酶偶联的反应测定血清和尿液中尿素，不受内源性氨离子的干扰。尿液不需预稀释，LED在与氨反应较GLDH特异，因此认为最新推出的UV-LED法对氨离子抗干扰的能力明显强于UV-GLDH法 [11] 。
参考文献
[1]Francis Lespinas,Georges dupuy,Francoise Revol and daude Audry Enzymic Urea Assay:A new Colorimetric Method Based on Hydrogen Pydrogen.Peroxide Measurement,Clin chem. Vol35,No4.198
[2]谢圣高，邹光楣，郭远华，上生所质控血清中尿素氮标示值的探讨，陕西医学检验，2001，16(2)：39
[3]Orsonneau JL,Massoubre C,Cabanes M,et al.Simple andsensitive determination of urea in serum and urine,clin chen,1992,38(5):619 ......
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