通络化纤合剂对矽肺患者AM介导的肺成纤维细胞的干预(1)
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【摘要】 目的：探讨通络化纤合剂对矽肺患者肺纤维化的防治作用；方法：将人胚肺成纤维细胞(FB)分为6组：肺泡巨噬细胞(AM)粉尘刺激组，AM粉尘加中药干预高、中、低剂量组、无粉尘刺激组和空白对照组，比较各组FB 中TGF-β1和TGF-β1和Ⅲ型胶原蛋白的表达；结果：AM粉尘刺激组和无粉尘刺激组FB中TGF-β1和Ⅲ型胶原蛋白的表达明显增加(P<0.01或0.05)，AM粉尘加中药干预高、中、低剂量组与AM粉尘刺激组和无粉尘刺激组比较有显著性差异(P<0.01或0.05),且中药干预高剂量组97%),180℃恒温下烘烤6h,用无血清培养液DMEM(Dulbeccos Modified Eagles’s Medium)配成浓度为50μg/ml粉尘悬液,4℃储存备用;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)中国医学科学院血液学研究所),56℃30min灭活补体后分装,-20℃保存;兔抗人TGF-β1多克隆抗体、鼠抗人p-p38单克隆抗体(SantaCruz)、羊抗兔IgG及SP(链霉卵白素-过氧化物酶)免疫组织化学试剂盒(天津灏洋生物有限公司);SB203580碧云天生物技术研究所。
1.2 实验方法
1.2.1 通络化纤合剂不同浓度药液的制备
通络化纤合剂(当归10g，地龙10g、仙灵脾10g、瓜蒌15g、姜黄30g、白芥子6g、黄连6g、清半夏12g、牡蛎30g、党参15g、炙甘草6g)由河北联合大学中药房提供，经水煎、醇沉、滤过，滤液浓缩至干，密封于灭菌安瓿备用。用时分别配成20ug/ml、50ug/ml、100ug/ml浓度的药液，调pH值至7.2。
1.3 矽肺患者AM及其培养上清获得
1.3.1 矽肺患者AM及其培养上清获得：患者,男,44岁,接岩尘8年,诊断为Ⅱ期矽肺,无其他合并症(患者肺泡灌洗液由中国煤炭工人北戴河疗养院尘肺康复中心友好提供)。患者在全麻下肺灌洗。灌洗液于冰浴条件下移至实验室内，经两层无菌纱布过滤后，4℃，1500rpm，离心20min。细胞团用PBS洗涤两次后，加入10%FBS的培养液，混匀后常规计数和台盼蓝排斥实验。计数得细胞总数为1.12×108，95%以上细胞存活。吸取适量培养液，将细胞稀释成1×106/ml细胞悬液。一部分置于预先放置了无菌小玻片的24孔培养板中，每孔1ml，另一部分放置于培养瓶中。37℃培养1.5h，使AM贴壁。弃去培养液，重新在培养板和培养瓶内加入10%FBS的培养液，继续培养。
1.3.2 人胚肺成纤维细胞的培养
取新鲜引产胎儿，常规消毒，无菌条件下取出肺脏，于平皿中将胚肺剪切成糜状，涂于组织培养瓶底。将培养瓶轻轻翻转，在另一面加入少量含有HEPES的10%FBS-DMEM(以刚好漫过瓶底为宜)。置37℃，5%CO2的条件下进行培养，3h将培养瓶轻轻翻转过来，使培养液漫过组织碎块，继续培养。24h后更换培养液，每瓶加入5ml，以后每周更换培养液2-3次，待细胞长成交汇层后进行传代培养。以IV代细胞用于实验。
1.3.3 细胞接种及同步化
取FB胰酶消化后，调成密度为1×105/ml细胞悬液，接种于96孔(MTT)、24孔培养板内，每孔1ml。以含10%FBS的DMEM培养液培养24h后换成含0.5%FBS的DMEM培养液继续培养48h使其同步化。
1.3.4 实验分组：
(1)AM粉尘刺激组(S组)：每孔加入经SiO2粉尘刺激18小时的AM条件培养上清200μl，再加入6%FBS的DMEM培养液200μl，使FBS的终浓度为3%。(2)AM粉尘刺激药物干预组1(DS1组)：每孔加入经SiO2粉尘刺激18小时的AM条件培养上清200μl，同时加入20ug/ml浓度通络化纤合剂药液100μl，再加入12%FBS的DMEM培养液100μl，使FBS的终浓度为3%。(3)AM粉尘刺激药物干预组2(DS2组)每孔加入经SiO2粉尘刺激18小时的AM条件培养上清200μl，同时加入50ug/ml浓度通络化纤合剂药液100μl，再加入12%FBS的DMEM培养液100μl，使FBS的终浓度为3%。(4)AM粉尘刺激药物干预组3(DS3组)每孔加入经SiO2粉尘刺激18小时的AM条件培养上清200μl，同时加入100ug/ml浓度通络化纤合剂药液100μl，再加入12%FBS的DMEM培养液100μl，使FBS的终浓度为3%。(5)无AM粉尘刺激组(C组)：每孔加入未经SiO2粉尘刺激18小时的AM条件培养上清200μl，再加入6%FBS的DMEM培养液200μl，使FBS的终浓度为3 %。(6)空白对照组(C0组)：每孔仅加入含3%FBS的DMEM培养液400μl。
1.3.5 观测方法：
1.3.5.1 将上述分组的培养板在37℃，5%CO2的条件下进行培养，于3、7、14、21、30天吸出培养液，取出小玻片，用PBS冲洗两遍，4%多聚甲醛固定10min，将收集的上清用紫外分光光度法进行蛋白定量 ......
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