高效液相色谱法在黄连上清片中有效成分的含量测定
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【摘要】 目的：建立黄连上清片中大黄素、大黄酚的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法、色谱柱为Diamonsi C18(250mm×4.6mm,5μm)，流动相为乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液(42：23：35)，检测波长为254nm。结果：大黄素和大黄酚分别在3.85μg -61.60μg (r=0.9998)和 6.30μg -100.80μg (r=0.9997)之间线性关系良好，大黄素的平均加样回收率为99.35%，RSD为0.28%；大黄酚的平均加样回收率为101.24%，RSD为0.08%。结论 ：该方法准确可靠，分离度好，可用于黄连上清片的质量控制。
【关键词】黄连上清片；大黄素；大黄酚；高效液相色谱法
黄连上清片是由黄连、大黄、连翘、薄荷、黄芩、栀子等十七味药制成的中药成方制剂，收载于《中国药典》2010年版一部[1]，具清热通便，散风止痛。用于头晕目眩，暴发火眼，牙齿疼痛，口舌生疮，咽喉肿痛，耳痛耳鸣，大便秘结，小便短赤。其中大黄是该制剂的主要成分，而大黄的主要成分为大黄素、大黄酚等[2]，具泄热通肠，凉血解毒等功效[3]。本文对现行标准进行了提高，增加了大黄的含量测定。结果表明该方法准确可靠，灵敏，可用于黄连上清片的质量控制。
1仪器与试药
岛津2010高效液相色谱仪，紫外检测器，色谱数据处理工作站：LCsolution色谱工作站；大黄酚对照品(批号：110796-201017， 中国药品生物制品检定所)；大黄素对照品(批号：110756-200110，中国药品生物制品检定所)；黄连上清片(市售，批号：101205、101206、101208)；甲醇、乙腈均为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为纯化水。
2方法与结果
2.1色谱条件 色谱柱：Diamonsi C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液(42:23:35)；流速：1.0ml•min-1；检测波长：254nm；进样量10μL；柱温：40℃；理论塔板数按大黄素峰计算应不低于2000。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备：分别精密称取大黄素对照品4.90mg和大黄酚对照品15.00mg，加甲醇溶解定容至100ml，精密量取10ml置100ml容量瓶中加甲醇稀释至刻度，即得(含大黄素 4.9μg•ml-1,大黄酚 15μg•ml-1)。
2.2.2供试品溶液的制备：取本品20片，除去包衣，精密称定重量，研细，精密称取适量(约相当于1片重)，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(10:1)的混合溶液25ml，称定重量，置80℃水浴中加热回流30分钟，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液5ml，置10ml量瓶中，加2%的氢氧化钠溶液2ml，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3阴性溶液的制备：取缺大黄的处方，按“2.2.2”方法制备阴性对照溶液。
2.3系统适应性试验：精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各10μL，按2.1项下色谱条件进样。结果，供试品与大黄素对照品和大黄酚对照品在对应的位置上出现色谱峰，且供试品色谱峰中基线平稳，分离度很好；阴性溶液在该位置上无色谱峰出现，表明阴性溶液不干扰样品测定。见图1-3。
2.4线性关系考察精密称取大黄素对照品6.16mg和大黄酚10.08mg加甲醇定容至100 ml，得对照品储备液，用上述混合液分别稀释0、2、4、8、16倍制成一系列线性溶液，每个浓度重复进样2次，按2.1项下色谱条件进样，测定峰面积，以浓度(X)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标，得大黄素回归方程为Y=20866.30X+4648.25(Y=0.9998)，大黄酚回归方程为Y=87168.87X+9950.16(r=0.9997)。结果表明，大黄素在3.85μg -61.60μg、大黄酚在6.30μg -100.80μg范围内浓度与峰面积线性关系良好。
图1对照品色谱图
图2阴性样品色谱图
图3供试品色谱图
2.5精密度试验精密吸取对照品溶液，按2.1项下色谱条件重复进样6次，每次10μL，测定峰面积。结果大黄素RSD为0.25%，大黄酚RSD为0.19%。
2.6稳定性试验精密吸取样品溶液10μL，分别在0、2、4、6、8、12、24h进样，测定峰面积。结果大黄素RSD为0.93%，大黄酚RSD为0.49%，表明该溶液在24h内稳定性良好。
2.7重复性试验取同一批(批号：101208)样品适量，共6份，照2.2.2项下方法制成供试品溶液，按原色谱条件测定含量。大黄素平均含量为0.141 mg/片，RSD为1.12%；大黄酚平均含量为0.565 mg/片，RSD为1.36%。
2.9加样回收率试验取2.7项下的同批样品(大黄素含量为0.141 mg/片，大黄酚含量为0.565 mg/片)适量，共5份，精密加入大黄素对照品、大黄酚对照品适量，按2.2.2项下方法制成供试品溶液，按原色谱条件测定，计算回收率。结果见表1。
表1加样回收率试验结果(n=5)
测定成分取样量g样品含量μg加入量μg测得量μg回收率%平均回收率%RSD%
大黄素0.2276
0.2256
0.2268
0.2281
0.228670.5560
69.9360
70.3080
70.7110
70.866070.6500
70.6500
70.6500
70.6500
70.6500140.0905
139.1380
140.2955
140.9370
140.553799.21
98.97
99.53
99.70
99.3299.350.28
大黄酚0.2276
0.2256
0.2268
0.2281
0.2286281.7688
279.2928
280.7784
282.3878
283.0068280.75
280.75
280.75
280.75
280.75568.8190
567.0433
569.0529
570.2333
570.6346101.12
101.25
101.34
101.26
101.22101 ......
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