树突状细胞的培养与鉴定(2)
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2 结果
2.1 单核细胞的分离与树突状细胞的培养 倒置显微镜下观察，磁珠分离得到的单核细胞圆形均质，悬浮，细胞纯度大于90%。在加入细胞因子GM-CSF和IL-4后，细胞培养第二天可见悬浮的细胞簇。培养第3-4天，可见部分细胞出现毛刺样的突起，培养至第7天，大部分细胞呈单个悬浮，并有明显的毛刺样突起，如图1所示。
图一：典型的树突状细胞(×40)
2.2 细胞表型 流式细胞仪对新鲜分离的单核细胞以及培养至第7天的树突状细胞表面抗原进行分析，检测细胞表面CD14、CD80、CD86、HLA-DR等分子的表达情况。结果显示新鲜分离的单核细胞高表达细胞抗原CD14，而培养至第7天的树突状细胞表面出现特异性抗原CD1a、CD80、CD86、HLA-DR, 而不再表达单核细胞抗原CD14，结果如图二所示。
2.3 淋巴细胞增殖反应 新生儿脐带血中含有大量的初始型T淋巴细胞，仅树突状细胞可以刺激初始型T淋巴细胞增殖(Sallusto，1994)。细胞在树突状细胞作用4天后，数量明显增加(如图三所示).
3 讨论
抗原递呈细胞始动和调节免疫反应的发生，尤其是DCs在针对外来抗原的初始免疫反应中发挥关键作用(Banchereau，1998； Sumida，2004)。越来越多的研究显示DCs由于表皮LC细胞的分离培养过程复杂，细胞数量有限，而血液中的DCs含量也极少，直接分离存在很大困难。因此，我们采用分离DCs前体细胞即单核细胞的方法，在细胞因子诱导下培养DCs，这一方法操作相对简便，技术较成熟，且细胞保持体内未成熟DCs摄取加工抗原的特性，具有典型的突起，高表达MHCⅠ和MHCⅡ分子。
研究表明，从单核细胞诱导分化而来的DCs主要具备以下特点(Salluato F，1994)：1)典型的细胞形态和细胞的活动性；2)细胞的表型，高表达CD1、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、Ii、FcμRⅡ、B7、CD40、ICAM-1、LFA-3、CD11c；3) 刺激初始型T细胞增殖能力强，DCs是唯一可以激活脐带血T细胞增殖的抗原递呈细胞。因此，对树突状细胞的鉴定主要从这三个方面来进行。
经GM-CSF、IL-4共同培养的DCs是高度同质性的一群细胞，细胞的大小，形态，表型高度一致，方便实验研究，但是体外培养的DCs与体内的DCs还是具有这明显的差别。研究发现，体外培养的DC具有MPO蛋白，并表达LZ和M-CSFR。但这些标志并不经常在体内的DCs如朗格汉斯细胞及淋巴系DC检测到(Pickl，1996)，并且有实验证实皮肤DCs即LCs从体内分离后，短时间体外培养，表型会发生明显改变(Victor，2001)。另外，细胞因子的质量在DCs培养过程中作用尤其重要，RD公司的细胞因子质量最好，有研究表明RD公司的IL-4浓度为5ng/ml就可诱导单核细胞分化。本研究经过多次实验发现GM-CSF终浓度50ng/ml，IL-4终浓度25ng/ml可起到较好的效果。
参考文献
[1]Banchereau Jacques, Steinman RM. Dendritic cell and the control of Immunity Nature, 1998，392(19): 245-252.
[2]Sallusto F，Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha ......
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