树突状细胞的培养与鉴定(1)
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【摘要】 目的 研究利用磁珠分离方法获取单核细胞，用细胞因子GM-CSF和IL-4联合诱导使之分化为树突状细胞(dendritic cells, DCs)的方法，并对培养的细胞从形态，表型，功能等三个方面进行鉴定，从而探索出一套较成熟的DCs的培养方法。方法 通过密度梯度离心的方法获取白细胞悬液中的白膜层，然后通过磁珠分离的方法，收集高纯度的单核细胞。在细胞因子GM-CSF和IL-4的刺激下，将细胞培养至7天左右，收集细胞进行流式分析，并进行淋巴细胞增殖实验，鉴定细胞是否为树突状细胞。 结果 在倒置显微镜下观察，细胞培养第7天，大部分细胞呈单个悬浮，并有明显的毛刺样突起。流式分析发现细胞高表达DC表面特异性抗原CD80，CD86，HLA-DR，并且不再表达单核细胞表面抗原CD14，细胞纯度约为93.12%。淋巴细胞增殖实验显示DCs可明显刺激初始型淋巴细胞增殖。 结论 通过磁珠分离的方法获得单核细胞并利用GM-CSF和IL-4细胞因子诱导可成功培养出纯度高的树突状细胞。
【关键词】 树突状细胞；磁珠；流式
Molecular and functional characteristics of dendritic cells differentiated from highly purified blood monocytes.
【Abstract】 Objectives：To develop a simple and efficient method to generate human dendritic cells (DCs) from highly purified CD14 + monocytes from human peripheral blood. Methods：Monocytes were purified by negatively sorting peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with dynal magnetic negative isolation kit. Monocytes were then differentiated into immature dendritic cells stimulated by the combination of interleukin-4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factors (GM-CSF) for 7days. Cells were analyzed for phenotype by flow cytometry。Allogenic lymphocyte proliferation assay was done by mixing dendritic cells with nave cord blood mononuclear cells and then coculture for 4 days. Results：Upon culture with GM-CSF plus IL-4, CD14+ cells rapidly became non-adherent clustered, developed into a morphologically homogeneous cell population with different extents of veiled morphology. Analysis of surface markers showed that the cells became CD14- and expressed high levels of HLA-DR、CD80、CD86, and CD40. Cells showed high capacity of stimulating nave lymphocytes to proliferate. Conclusions: FACs analysis and functional capacity identified the cells with typical veils as dendritic cells.
【Key words】 Dendritic cell, magnetic, flow cytometry
树突状细胞(Dendritic cells， DCs)是免疫系统中强有力的免疫调控细胞(Banchereau,1998)。随着树突状细胞在基因治疗及免疫治疗的应用，以及人们对免疫反应机制的不断探索研究，树突状细胞的分离、纯化、培养与鉴定技术也得到了飞速的发展。目前国内实验室在如何在体外培养出高质量的DCs的技术依然很欠缺。本研究在国外一些研究的基础上，经过改进探索了一套较成熟、简单、高效的培养树突状细胞的方法，并通过细胞形态、表型、功能等方面鉴定细胞为树突状细胞，为今后这方面的实验研究提供一条可供选择的技术方法。
1 材料与方法
1.1 树突状细胞的培养 取20ml左右的新鲜分离的白细胞悬液(武汉市中心血站) ......
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