胎盘CYP3A4的表达及其与ICP关系的研究(2)
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1.2 方法
1.2.1 标本收集：血标本的收集：剖宫产术前30分钟在无菌条件下分别抽取对照组和ICP组孕妇空腹肘静脉血，胎盘离体后15分钟内抽取脐静脉血各3ml，静置2小时后以3000 rpm离心5分钟，将上清液分别移至3个EP管中，保存于-80℃冰箱。胎盘组织标本的收集：胎盘离体后15分钟内取胎盘中央的绒毛组织(去除羊膜及蜕膜组织)3块，每块约50～100mg，无菌纱布尽量吸干血液，放入预先用DEPC处理过的冻存管中，﹣80℃冰箱中保存。冻存管内的小块胎盘组织于3个月内提取总RNA。
1.2.2 实验方法：⑴TBA：采用速率法测定TBA，试剂由美国ROCHZ公司提供，仪器为日立7600全自动生化分析仪。⑵组织总RNA和cDNA的合成：采用Trizol法提取胎盘绒毛组织总RNA。按试剂盒(购自立陶宛MBI公司)所推荐的方法合成cDNA。采用RT-Nested PCR法测定胎盘组织CYP3A4 mRNA。⑶引物和探针：由上海生物工程有限公司设计合成。CYP3A4：目的基因片段长度207bp，外侧上游引物：5'-TTCCTCCCTGAAAGATT-3'，外侧下游引物：5'-TTTCTGGTTGAAGAAGT-3'，上游引物：5'-CTGAAAGATTCAGCAAGAAG-3'，下游引物：5'-GTTGAAGAAGTCCTCCTAAG-3'，TaqMan探针：5'-FAM-CATTGGCATGAGGTTTGCTCTC-TAMRA-3'。内参β-actin：目的基因片段长度114bp，上游引物：5'-GCCAACACAGTGCTGTCT-3'，下游引物：5'-AGGAGCAATGATCTTGATCTT-3'，TaqMan探针：5'-FAM-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-TAMRA-3'。⑷RT-Nested PCR：①CYP3A4普通PCR总反应体系30μl，其中含10×buffer(Mg2+ free) 3μl，MgCl2(25mM) 2.5μl，dNTP(25mM) 0.36μl，上游引物(10μM) 1μl，下游引物(10μM)1 μl，Taq酶(5u/μl) 0.3μl，ddH2O 19.84μl，cDNA模板2μl。反应条件：94℃预变性2分钟，94℃变性20秒，44℃复性30秒，72℃延伸40秒，循环20次。②CYP3A4及内参β-actin RT PCR总反应体系30μl，其中含10×buffer(Mg2+ free) 3μl，MgCl2(25mM) 3μl，dNTP(25mM)0.36μl，上游引物(10μM) 1 μl，下游引物(10μM)1μl，探针(10μM) 0.6μl，Taq酶(5u/μl) 0.3 μl，ddH2O18.74μl，cDNA模板2μl。反应条件：94℃预变性2分钟，94℃变性20秒，52℃复性收集荧光30秒，60℃延伸40秒，循环45次。
1.2.3 统计学方法 正态资料采用均数±标准差(x±s)，偏态资料采用中位数(四分位间距)(M(QR))表示，统计方法采用t检验、Wilcoxon秩和检验、Pearson相关分析、Spearman秩相关分析，检验水准α(双侧)=0.05。所有数据均输入计算机利用SPSS13.0软件进行统计分析。
2 结果
2.1 胎盘组织中CYP3A4 mRNA的表达
2.1.1 ICP及正常妊娠胎盘组织中均有CYP3A4 mRNA的表达。ICP组胎盘CYP3A4 mRNA表达量低于对照组，差异有统计学意义(z=﹣2.368, P<0.05)。见表1。
表1 ICP组与对照组胎盘组织CYP3A4 mRNA表达量比较(M(QR))
注： Wilcoxon秩和检验(z值)
2.1.2 DEX治疗对胎盘CYP3A4 mRNA表达的影响 ICP DEX治疗组胎盘CYP3A4 mRNA表达量高于未用DEX治疗组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
表2 DEX治疗组与未用DEX治疗组胎盘组织
注： Wilcoxon秩和检验(z值)
2.2 胎盘组织CYP3A4 mRNA表达量与母血和脐血中TBA的相关分析 对照组和ICP组胎盘组织中CYP3A4 mRNA表达量与母、脐血中TBA水平之间均不具有相关性(rs＝﹣0.330,﹣0.060,﹣0.115,﹣0.229, P >0.05)。见表3。
表3 胎盘组织CYP3A4 mRNA表达量与母血和脐血中TBA的相关性
注： Spearman秩相关分析(rs值)
3 讨论
在ICP患者围生儿结局不良相关的危险因素中，增高的胆汁酸水平为主要的危险因素[6]。母胎体内胆汁酸的代谢及母胎间胆汁酸经胎盘的转运是妊娠期胆汁酸循环的关键[7]。我们既往[8][9]及Serrano等[10]研究显示，ICP患者胆汁酸经胎盘的转运受到影响。有学者认为，ICP实际上是母-胎通过胎盘进行胆汁酸代谢发生障碍的母胎间疾病[11]。胎盘对胆汁酸转运障碍和胎盘代谢异常可能是造成ICP胎儿预后不良的两个环节。组织中胆汁酸代谢相关酶与人体内胆汁酸代谢密切相关。细胞色素P450(cytochrome P450，CYP)酶是内质网膜上混合功能氧化酶，是I相代谢的主要酶系，为生物体内参与内源性化合物和外源性化合物生物转化的主要酶系。CYP3A4是成人肝微粒体CYP酶中最重要的成分之一，约占CYP酶总量的30%～40%，居第1位[12]。研究表明CYP3A4在维持胆汁酸内环境稳定方面起重要作用，参与疏水性胆汁酸的代谢过程，将疏水性胆汁酸转化为亲水性胆汁酸以利于从机体中排出[13]。以往CYP3A4与胆汁淤积关系的研究多集中在肝脏。间接证据显示胆汁淤积可诱导肝脏CYP3A4的表达。Karl等[14]对人重组体CYP3A4的研究发现CYP3A4对疏水性胆汁酸的亲和力尤为强 ......
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