用VRA-GlcNAc为底物测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶
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【摘要】 目的 应用VRA-GlcNAc为底物建立检测NAG活力的方法，用于尿液NAG活性测定。方法 对离子强度、pH值、底物浓度等最佳反应条件及各种实验参数进行研究。用该法在日立7180全自动生化分析仪上进行性能分析并测定多种肾病尿样NAG活性，结果 该法最低检出限1.5 U/L，线性范围可达200U/L(r=0.9979)，批内CV为<4%，批间CV<6%,回收率为101.2%。结论 本法灵敏度高，结果准确，试剂稳定，适用于全自动生化分析仪操作。
【关键词】 VRA-GlcNAc；N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶；动力学法
N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)是一种位于溶酶体内的酸性水解酶，尿中NAG主要来源于肾近曲小管上皮细胞，当近曲小管上皮细胞受损时，尿NAG活性将显著升高且早于其他尿酶，对肾小管损害的早期诊断有较大价值[1]，且NAG上升程度与肾小管损伤程度成正比。[2]可作为早期诊断肾损害的尿标志性蛋白[3]。本文基于NAG催化VRA-GLCNAC生成红色VRA产物，经反复试验确定最佳实验条件，建立检测尿NAG活力的动力学分析法，该法用于尿NAG活力测定，均获得满意结果。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器 (1)试剂1(R1)：柠檬酸缓冲液150mmol/L、VRA-GlcNAc1.0g/L、稳定剂适量。(2)试剂2(R2)：pH碳酸钠缓冲液(10.0)。(3)NAG标准酶和质控品，由浙江伊利康生物技术公司提供。
1.2 样本 随机中段尿样。
1.3 方法
1.3.1 测定原理 样本中的NAG催化底物VRA-GlcNAc水解糖苷链,，生成产物VRA，VRA在505nm处有最大吸收峰，通过测定505nm处每分钟的吸光度变化速率，可计算出NAG的活性。即在最佳实验条件下，1000ml样品中NAG每分钟水解1μmol/L 的VRA-GlcNAc发生转变为1U的NAG酶量为1个单位，简称U/L。
1.3.2 实验参数 终点法，主波长：505nm；温度：37℃；试剂样品比：20：1。
1.3.3 统计学处理实验数据的统计学处理采用SPSS10.0统计软件。
2 结果
2.1 最适缓冲离子强度的选择 分别配制50、100、150、200mmol/L的柠檬酸缓冲液，其它条件不变。分别测试同一份样品(45U/L)进行测试。酶反应速率随缓冲液浓度的增加而增高的，但当浓度大于150mmol/L时，酶反应速率反而降低。这是缓冲液浓度太大反而抑制了NAG酶的活性，从而导致反应变慢。因此，选择柠檬酸浓度150mmol/L作为最佳缓冲液和最佳浓度。
2.2 最适PH的选择 分别配制pH4.4、4.6、4.8、5.0、5.2的柠檬酸缓冲液，其它条件不变。对45U/L NAG标准酶进行测定，在pH4.8时酶促反应速率最大。
2.3 底物浓度选择 在其他条件不变的情况下，将试剂1中VRA-GlcNAc浓度分别调整至 0.5、1.0、1.5g/L,分别测定高、中、低3种浓度质控品。结果显示试剂1中VRA-GLCNAC浓度为1g/L时底物浓度与酶反应速度的反应曲线尾部已趋于平坦，说明反应速度已到最大值，测定此处的反应速度，最能准确反映酶量的多少。所以试剂1中VRA-GLCNAC的浓度确定为1g/L。
2.4 反应时间的选择 在其它条件不变的情况下，用样本按反应条件进行操作，观察60～300S内各时间的吸光度变化，可见到时间变化与吸光率变化为线性关系。
2.5 精密度试验 根据NCCLS(EP-5)的评估方案，取1份尿液作批内和批间试验，测定次数20次，结果批内CV为3.2%，批间CV为5.4%。
2.6 回收试验 在1份样品中分别加入低、中、高3个浓度的NAG质控品，同时样品中加入相同体积的蒸馏水做基础样本，每份样品重复测定3次，取均值，所得回收率分别为101.4%、102.3%、99.8%，平均回收率101.2%。
2.7 线性试验 根据NCCkS(EP6.P)的评估方案，取浓度分别为10U/L和200 U/L标本各1份。然后将两份标本按1：0、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、0:1的比例混合，产生9个不同浓度的样品，用本法从高到低和从低到高两个浓度顺序测定，将测定值(y)与理论值(X)作线性回归分析，回归方程为Y=1.005X-0.281，r=0.9979，表明线性可达200 U/L。
2.8 最低检测限 取浓度为5 U/L的质控品作为样品重复测定10次，求出标准差S,以3S为最低检测限，结果为1.5U/L。
2.9 参考范围 测定40例体检健康者尿液样本，男26例，女14例，年龄20~60岁，均无肾脏疾患、高血压、糖尿病史.未曾服用肾毒性等药物 常规尿蛋白定性和尿沉淀镜检验均呈阴性，正常值尿NAG活性以NAG(U/L) ，NAG()男性为(8.83±2.12)U/L，女性为(9.16±2.03)U/L，男女间无显著差异(P>0.05),，取总体士1.96 s作为参考值，结果为(9.07±3.89)U/L.随机测定64例各种肾病患者的尿NAG活性，肾病患者组尿NAG活性均明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)
3 讨论
近年来，随着对NAG的研究不断深入，其检测方法也在不断发展。主要有荧光分光光度法和可见分光光度法。前者因所需仪器价格昂贵，且对底物溶液配制的要求较高而不宜用作一般医院常规检验；后者试剂稳定性欠佳，难以满足临床检验要求,目前都采用PNP-NAG和CNP-NAG、MNP-NAG作底物建立的方法[4-5],这些方法由于在液体状态下不稳定，造成试剂浪费严重，临床难于推广。本文以VRA-GLCNAC底物建立的NAG测定试剂优点在于试剂在液体状态稳定性好 ......
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