免疫细胞化学染色在骨髓涂片诊断中的应用
【摘 要】 目的：分析免疫细胞化学染色在骨髓涂片诊断中的应用价值。方法：在骨髓涂片上直接进行免疫细胞化学标记进行明确诊断。结果：结合免疫细胞化学，可达到准确鉴别诊断的要求。结论：应用免疫细胞化学技术对肿瘤性骨髓涂片进行抗原标记，取得了良好的效果，有助于明确疾病的鉴别诊断。
【关键词】 骨髓检查；免疫组织化学；诊断
免疫组化在外科病理学上已经被广泛应用，但常规应用于细胞学上还不多，而在细胞病理学中面临的主要问题是弄清细胞的来源和性质，传统的形态学方法和标准能满足多数分化细胞的分类和诊断，但对难以辨认的肿瘤细胞，免疫细胞化学(ICC)在细胞病理学中是一很有用的辅助诊断方法，结合免疫细胞化学，可达到准确鉴别诊断的要求。但多数免疫细胞化学在胸腹水恶性肿瘤的应用，在骨髓涂片上直接进行免疫细胞化学标记进行明确诊断少见报道。笔者应用免疫细胞化学技术对肿瘤性骨髓涂片进行抗原标记，取得了良好的效果，有助于明确疾病的鉴别诊断。
1 临床资料
1.1 一般资料
选取我院10例患者恶性骨髓涂片，骨髓涂片诊断尚有困难或怀疑有其他转移性肿瘤但又无法活检明确诊断的骨髓涂片。
1.2 试剂
小鼠抗人CK、CD20、CD79a、CD3、CD43、CD45RO、CD56、Syn、LCA、及MaxVision试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。
1.3 免疫细胞化学方法
(1)根据临床病史及常规HE初步诊断，对抗体筛选不同抗体的标记；(2)观察骨髓涂片细胞量(除红细胞)较多的区域，并用免疫组化笔划圈直径约1cm，太小细胞量少且玻片容易干燥，过大浪费抗体；(3)骨髓涂片放入乙醇乙醚固定液固定5min，水洗5min，PBS液冲洗，一抗室温孵育1h；PBS液冲洗，二抗室温孵育15min；PBS液冲洗，DAB显色；PBS代替一抗作阴性对照。最后苏木精复染，中性树胶封固。
取骨髓液3-5ml肝素抗凝，Ficoll液分离单个核细胞，用PBS洗涤3次，调细胞浓度为1-2×106/ml，甩片凉干。甲醇：丙酮(1：1)固定细胞，置于10mmol/L的PBS液洗涤3次，每次2分钟，滴加1抗，然后PBS液洗涤3次，每次2分钟，再加入生物素化酶联2抗，室温湿盒中放置30-45分钟，PBS洗涤3次，每次2分钟，二氨基联苯胺(DAB)液显色。显微镜下观察显色情况，适时流水终止反应，苏木素复染细胞核。细胞膜浆或细胞核中见到明显的棕黄色为细胞阳性。根据需要采用不同抗体组合。
1.4 结果判断
CK(Pan)、CD20、CD79a、CD3、CD43、CD45RO、CD56、Syn、LCA阳性均定位于细胞膜或细胞浆，抗体均定位比较准确，背景不明显。
2 结果
10例骨髓涂片中。其中1例CK(Pan)、CD56和Syn阳性表达，结合形态学观察，诊断为转移性小细胞癌，该患者有食管小细胞癌手术病史。结合骨髓涂片诊断淋巴细胞增生免疫细胞化学既有T系抗原表达又有B系抗原表达4例；单克隆B系表达3例；单克隆T系表达2例。
3 讨论
传统血液形态学是以外周血涂片和骨髓涂片为主的细胞形态学检验，时至今日仍是血液病诊断重要的方法。但是，我们也应该清醒地看到，由于血细胞自动分析仪和分子生物学等新技术对传统血液形态学检验的影响，有必要强调和正视传统血液形态学检验自身的价值和存在的问题。有90%的淋巴瘤患者有克隆性染色体异常，不同类型常有特异性的改变。如滤泡细胞淋巴瘤常发生t(14；18)；伯基特淋巴瘤t(8；14)；套细胞淋巴瘤t(11；14)；间变性大细胞淋巴瘤t(2；5)；弥漫性大细胞淋巴瘤易见t(3；var)等。本组结果也证实了部分染色体核型与淋巴瘤分型相关，其中1例ALCL发生罕见的t(2；3)(p23；q21)，但本组异常核型检出率较文献报道低。本文7例骨髓轻度受累患者中2例检出核型异常。部分淋巴瘤患者的骨髓像细胞形态显示为正常，但检出异常染色体核型。上述结果提示细胞遗传学检查对发现NHL早期骨髓浸润有独特的诊断价值。
目前骨髓疾病病理诊断一般采用骨髓活检的方式进行，骨髓活检对转移性肿瘤、白血病、淋巴或髓性增殖性疾病等都能结合免疫组织化学进行明确诊断。骨髓涂片一般在医院检验科或血液科进行诊断，但有些骨髓涂片存在诊断困难或怀疑有转移性肿瘤，无法活检明确诊断，可直接在骨髓涂片上进行相应免疫抗原标记来明确诊断。免疫细胞化学对肿瘤鉴别诊断及寻找肿瘤原发灶起着十分重要的作用。随着细胞学新技术的发展，免疫细胞化学应用到体液细胞学、针吸细胞学及骨髓涂片细胞学上，为疑难病例的鉴别诊断、临床治疗提供帮助。临床上有些患者肿瘤细胞已经转移至骨髓。但原发灶有时很难找到，那么骨髓涂片中的肿瘤细胞免疫特异性抗体标记，再结合形态学观察，能给肿瘤原发灶的寻找提供病理学依据。
骨髓活检可反映骨髓增生程度，比骨髓涂片更有优势，因为涂片可能受窦血稀释，切片未涉及骨髓小粒因素影响，故怀疑再生障碍性贫血的患者必须做骨髓活检，具体讨论如下：①AL：由于目前白血病的FAB分型仍然依据骨髓涂片的细胞形态学，骨髓涂片可提供清晰的细胞形态，可显示急性白血病的病态造血现象和判断预后。但是对于某些病例，涂片证实已缓解，但活检切片中仍可发现簇状白血病细胞，这些病例缓解时间短，易复发，说明在化疗后微小残留病变方面，活检优于涂片。②MDS活检切片较穿刺涂片更易发现幼稚细胞增高及病态巨核细胞，尤其是涂片无法发现的成簇或成灶状分布的幼稚粒细胞及ALIP现象。③再生障碍性贫血：骨髓活检因不受骨髓稀释等因素的影响，因而不易造成骨髓增生度减低、巨核细胞数量减少，其次活检取材取得的是完整的骨髓组织，可以观察到造血细胞的数量和分布，尤其是巨核细胞的数量以及骨髓基质的变化。④MF：晚期骨髓增生低下，骨小梁增生，除巨核细胞外，其他造血细胞减少，但网状纤维显著增多，有别于AA。⑤MM：骨髓涂片和骨髓切片中浆细胞的浸润程度差异有显著性，活检是对体内肿瘤负荷更敏感的检查手段。⑥ML：骨髓活检切片较骨髓涂片对瘤细胞浸润判断更为敏感。⑦骨髓转移性肿瘤，经骨髓活检，配合特殊染色及免疫组化，可以直接准确诊断，并能判断其来源。⑧CML：目前Ph染色体和(或)BCR/ABL融合基因是确诊本病的金标准。
在一些诊断困难的骨髓涂片上标记能够给临床诊断提供一定的帮助，但是也存在涂片时细胞分布不均匀和厚薄不均的现象，给诊断和免疫标记都造成一定的影响，骨髓涂片免疫细胞化学染色有一定的局限性，如何更好克服骨髓涂片肿瘤细胞不均匀等不利因素，更好的提高抗体在细胞学涂片上敏感性和特
异性，减少非特异背景着色，有待于进一步探讨。
参考文献
[1] 王超；李明；刘跃平；黄君富；骨髓涂片免疫组化在形态学难以诊断的急性白血病中的临床研究[J].国际检验医学杂志2009年06期.
[2] 刘华庆；胡莉；免疫组织化学双标记结合激光显微切割技术在霍奇金淋巴瘤诊断中的应用[J].肿瘤防治研究2010年04期.
[3] 李虎生；张华；396例恶性淋巴瘤骨髓涂片分析[J].检验医学与临床2010年21期.
[4] 樊心友；非霍奇金淋巴瘤侵犯骨髓176例淋巴瘤细胞形态观察分析[J].中国误诊学杂志2007年12期.
[5] 牟子新；浅谈骨髓转移癌临床表现与细胞形态特点[J].中国实用医药2008年23期.
[6] 施菊妹；骨髓活检与涂片联合应用于MDS诊断探讨[J].交通医学1999年04期.
[7] 万楚成；夏云金；刘瑜；章正华；杨华强；龙志国；郭仁慈；骨髓活检在多发性骨髓瘤诊断中的价值[J].临床血液学杂志2004年02期., 百拇医药(牟辉)
【关键词】 骨髓检查；免疫组织化学；诊断
免疫组化在外科病理学上已经被广泛应用，但常规应用于细胞学上还不多，而在细胞病理学中面临的主要问题是弄清细胞的来源和性质，传统的形态学方法和标准能满足多数分化细胞的分类和诊断，但对难以辨认的肿瘤细胞，免疫细胞化学(ICC)在细胞病理学中是一很有用的辅助诊断方法，结合免疫细胞化学，可达到准确鉴别诊断的要求。但多数免疫细胞化学在胸腹水恶性肿瘤的应用，在骨髓涂片上直接进行免疫细胞化学标记进行明确诊断少见报道。笔者应用免疫细胞化学技术对肿瘤性骨髓涂片进行抗原标记，取得了良好的效果，有助于明确疾病的鉴别诊断。
1 临床资料
1.1 一般资料
选取我院10例患者恶性骨髓涂片，骨髓涂片诊断尚有困难或怀疑有其他转移性肿瘤但又无法活检明确诊断的骨髓涂片。
1.2 试剂
小鼠抗人CK、CD20、CD79a、CD3、CD43、CD45RO、CD56、Syn、LCA、及MaxVision试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。
1.3 免疫细胞化学方法
(1)根据临床病史及常规HE初步诊断，对抗体筛选不同抗体的标记；(2)观察骨髓涂片细胞量(除红细胞)较多的区域，并用免疫组化笔划圈直径约1cm，太小细胞量少且玻片容易干燥，过大浪费抗体；(3)骨髓涂片放入乙醇乙醚固定液固定5min，水洗5min，PBS液冲洗，一抗室温孵育1h；PBS液冲洗，二抗室温孵育15min；PBS液冲洗，DAB显色；PBS代替一抗作阴性对照。最后苏木精复染，中性树胶封固。
取骨髓液3-5ml肝素抗凝，Ficoll液分离单个核细胞，用PBS洗涤3次，调细胞浓度为1-2×106/ml，甩片凉干。甲醇：丙酮(1：1)固定细胞，置于10mmol/L的PBS液洗涤3次，每次2分钟，滴加1抗，然后PBS液洗涤3次，每次2分钟，再加入生物素化酶联2抗，室温湿盒中放置30-45分钟，PBS洗涤3次，每次2分钟，二氨基联苯胺(DAB)液显色。显微镜下观察显色情况，适时流水终止反应，苏木素复染细胞核。细胞膜浆或细胞核中见到明显的棕黄色为细胞阳性。根据需要采用不同抗体组合。
1.4 结果判断
CK(Pan)、CD20、CD79a、CD3、CD43、CD45RO、CD56、Syn、LCA阳性均定位于细胞膜或细胞浆，抗体均定位比较准确，背景不明显。
2 结果
10例骨髓涂片中。其中1例CK(Pan)、CD56和Syn阳性表达，结合形态学观察，诊断为转移性小细胞癌，该患者有食管小细胞癌手术病史。结合骨髓涂片诊断淋巴细胞增生免疫细胞化学既有T系抗原表达又有B系抗原表达4例；单克隆B系表达3例；单克隆T系表达2例。
3 讨论
传统血液形态学是以外周血涂片和骨髓涂片为主的细胞形态学检验，时至今日仍是血液病诊断重要的方法。但是，我们也应该清醒地看到，由于血细胞自动分析仪和分子生物学等新技术对传统血液形态学检验的影响，有必要强调和正视传统血液形态学检验自身的价值和存在的问题。有90%的淋巴瘤患者有克隆性染色体异常，不同类型常有特异性的改变。如滤泡细胞淋巴瘤常发生t(14；18)；伯基特淋巴瘤t(8；14)；套细胞淋巴瘤t(11；14)；间变性大细胞淋巴瘤t(2；5)；弥漫性大细胞淋巴瘤易见t(3；var)等。本组结果也证实了部分染色体核型与淋巴瘤分型相关，其中1例ALCL发生罕见的t(2；3)(p23；q21)，但本组异常核型检出率较文献报道低。本文7例骨髓轻度受累患者中2例检出核型异常。部分淋巴瘤患者的骨髓像细胞形态显示为正常，但检出异常染色体核型。上述结果提示细胞遗传学检查对发现NHL早期骨髓浸润有独特的诊断价值。
目前骨髓疾病病理诊断一般采用骨髓活检的方式进行，骨髓活检对转移性肿瘤、白血病、淋巴或髓性增殖性疾病等都能结合免疫组织化学进行明确诊断。骨髓涂片一般在医院检验科或血液科进行诊断，但有些骨髓涂片存在诊断困难或怀疑有转移性肿瘤，无法活检明确诊断，可直接在骨髓涂片上进行相应免疫抗原标记来明确诊断。免疫细胞化学对肿瘤鉴别诊断及寻找肿瘤原发灶起着十分重要的作用。随着细胞学新技术的发展，免疫细胞化学应用到体液细胞学、针吸细胞学及骨髓涂片细胞学上，为疑难病例的鉴别诊断、临床治疗提供帮助。临床上有些患者肿瘤细胞已经转移至骨髓。但原发灶有时很难找到，那么骨髓涂片中的肿瘤细胞免疫特异性抗体标记，再结合形态学观察，能给肿瘤原发灶的寻找提供病理学依据。
骨髓活检可反映骨髓增生程度，比骨髓涂片更有优势，因为涂片可能受窦血稀释，切片未涉及骨髓小粒因素影响，故怀疑再生障碍性贫血的患者必须做骨髓活检，具体讨论如下：①AL：由于目前白血病的FAB分型仍然依据骨髓涂片的细胞形态学，骨髓涂片可提供清晰的细胞形态，可显示急性白血病的病态造血现象和判断预后。但是对于某些病例，涂片证实已缓解，但活检切片中仍可发现簇状白血病细胞，这些病例缓解时间短，易复发，说明在化疗后微小残留病变方面，活检优于涂片。②MDS活检切片较穿刺涂片更易发现幼稚细胞增高及病态巨核细胞，尤其是涂片无法发现的成簇或成灶状分布的幼稚粒细胞及ALIP现象。③再生障碍性贫血：骨髓活检因不受骨髓稀释等因素的影响，因而不易造成骨髓增生度减低、巨核细胞数量减少，其次活检取材取得的是完整的骨髓组织，可以观察到造血细胞的数量和分布，尤其是巨核细胞的数量以及骨髓基质的变化。④MF：晚期骨髓增生低下，骨小梁增生，除巨核细胞外，其他造血细胞减少，但网状纤维显著增多，有别于AA。⑤MM：骨髓涂片和骨髓切片中浆细胞的浸润程度差异有显著性，活检是对体内肿瘤负荷更敏感的检查手段。⑥ML：骨髓活检切片较骨髓涂片对瘤细胞浸润判断更为敏感。⑦骨髓转移性肿瘤，经骨髓活检，配合特殊染色及免疫组化，可以直接准确诊断，并能判断其来源。⑧CML：目前Ph染色体和(或)BCR/ABL融合基因是确诊本病的金标准。
在一些诊断困难的骨髓涂片上标记能够给临床诊断提供一定的帮助，但是也存在涂片时细胞分布不均匀和厚薄不均的现象，给诊断和免疫标记都造成一定的影响，骨髓涂片免疫细胞化学染色有一定的局限性，如何更好克服骨髓涂片肿瘤细胞不均匀等不利因素，更好的提高抗体在细胞学涂片上敏感性和特
异性，减少非特异背景着色，有待于进一步探讨。
参考文献
[1] 王超；李明；刘跃平；黄君富；骨髓涂片免疫组化在形态学难以诊断的急性白血病中的临床研究[J].国际检验医学杂志2009年06期.
[2] 刘华庆；胡莉；免疫组织化学双标记结合激光显微切割技术在霍奇金淋巴瘤诊断中的应用[J].肿瘤防治研究2010年04期.
[3] 李虎生；张华；396例恶性淋巴瘤骨髓涂片分析[J].检验医学与临床2010年21期.
[4] 樊心友；非霍奇金淋巴瘤侵犯骨髓176例淋巴瘤细胞形态观察分析[J].中国误诊学杂志2007年12期.
[5] 牟子新；浅谈骨髓转移癌临床表现与细胞形态特点[J].中国实用医药2008年23期.
[6] 施菊妹；骨髓活检与涂片联合应用于MDS诊断探讨[J].交通医学1999年04期.
[7] 万楚成；夏云金；刘瑜；章正华；杨华强；龙志国；郭仁慈；骨髓活检在多发性骨髓瘤诊断中的价值[J].临床血液学杂志2004年02期., 百拇医药(牟辉)