中药含药血清对MRSAβ-内酰胺类抗生素耐药性及mecA\femA基因的影响
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【摘 要】 目的：研究中药在体内对MRSAβ-内酰胺类抗生素耐药性的影响。方法：采用中药含药血清与MRSA共同培养的方法进行耐药性逆转实验，用K-B纸片扩散法观察实验前后受试菌抑菌环直径的变化，同时进行耐药基因mecA、femA的检测。结果：对照组与实验组K-B纸片扩散法对比，五倍子、绿茶、防风、丹皮、黄芩、浙贝组对苯唑西林钠、头孢唑啉钠、头孢呋辛、头孢噻肟钠、头孢美唑等药物抑菌环直径扩大均有不同程度扩大，由耐药或中敏恢复为敏感；对青霉素抑菌环直径无影响，仍表现为耐药。MRSA标准菌株、对照组菌株均检测出耐药特异性基因mecA、femA，丹皮、五倍子、防风、黄芩、浙贝、绿茶组未测出femA基因， mecA基因条带显示明显减弱。结论：MRSA经五倍子、绿茶、防风、丹皮、黄芩、浙贝含药血清处理后均恢复了对耐酶β-内酰胺类抗生素的敏感性，且耐药基因mecA、femA的表达明显受抑制，推测其可能通过作用于mecA、femA或其调控因素，影响耐药基因的表达程度， 使PBP2a产生减少或消除，从而达到耐药性逆转的作用。
【关键词】 中药；MRSA；β-内酰胺；耐药；基因
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillin resistant staphyloc occus aureus，MRSA)是医院感染的重要病原菌之一。自1961年英国的Jevons首次报道MRSA感染以来，其发生率在全球范围内迅速增加，耐药程度不断加深。对于MRSA的治疗方法，虽然在新药研制与联合用药等方面有一些进展，但万古霉素仍然是临床首选药物。随着对万古霉素中敏或耐药金黄色葡萄球菌菌株(VISA/VRSA)的出现[1]，对抗生素的选择余地已越来越小，因而一部分学者将目光转移到耐药性逆转药物的研究上。近年研究发现，部分中药与抗生素联合应用可增强对MRSA的治疗效果，并对其耐药质粒有消除作用。本研究选用五倍子、防风、丹皮等中药含药血清对MRSA进行耐药性逆转试验，以观察中药在体内对MRSAβ-内酰胺类抗生素耐药性的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 MRSA标准菌株(ATCC43300)由卫生部临床检验中心惠赠，MRSA临床分离菌株由沈阳军区医学检验中心提供(K-B纸片扩散法苯唑西林抑菌环直径≤10mm，头孢西丁≤19mm)。
1.1.2 中药 五倍子、防风、黄芩、浙贝、丹皮等14种中药购自辽宁中医学院第三附属医院药剂科。
1.1.3 动物 Wistar大鼠购自沈阳军区总医院动物实验科。
1.1.4 试剂 M-H培养基(BD公司)、抗生素药敏纸片(北京天坛药物生物技术开发公司)、DNA提取试剂盒(上海博亚生物技术有限公司)、PCR引物(上海博亚生物技术有限公司)。
1.1.5 仪器 LIGHTCYCIER荧光定量PCR检测仪(罗氏公司)、DY-A电泳仪(上海生化所西巴斯生物技术开发公司)。
2 方法
2.1 中药煎剂制备 每味中药各100g，参考文献[2]方法分别煎煮至100ml药液。
2.2 含药血清制备 Wistar大鼠60只，♂♀各半，体重200±20g，每4只分为1组，共15组。对照组灌服生理盐水，实验组分别灌服单味中药煎剂(相当于生药5g/kg)，2次/日，共5日。末次给药2小时后眶内采血，无菌分离血清，将各组4只大鼠的血清混合备用。
2.3 耐药性逆转试验 各组取4ml含药血清加入5mlM-H肉汤中，37℃培养48h，取50μl培养物进行药敏试验, 选用苯唑西林钠、青霉素、头孢唑啉钠、头孢噻肟钠、头孢呋辛、头孢美唑等抗生素药敏纸片，采用WHO推荐的K-B纸片扩散法，观察对照组与实验组抑菌环大小的差异，以筛选出在体内对MRSA有逆转作用的单味中药。
2.4 耐药基因检测
2.4.1 模板DNA制备 各组取4ml含药血清加入5mlM-H肉汤中，37℃培养48h，划线法接种于M-H培养皿，37℃培养24h, 挑取单个MRSA菌落至10mlM-H液体培养基中37℃振荡过夜，离心收集细菌。DNA提取过程按试剂盒说明进行。
2.4.2 PCR扩增 参考文献[3]方法。mecA基因引物P1:5′TGGCTATCGTGTCACAATCG 3′，P2:5′CTGGAACTT GTTGA GCAGAG 3′，产物长310bp；femA基因引物P1：5′CTTACTT ACTGGCTGTACCTG3′，P2:5′ATGTCGCTTGTTATGTGC3′，产物长686bp。扩增总体积为25μl,其中包括:10×PCR缓冲液2.5μl、10mM4×dNTP2.5μl、15mMMgcl21.5μl、引物各1.25μl (50pmol/L)、DNA模板2.5μl、TapDNA酶0.1μl(1U)及无菌蒸馏水10.9μl。以无菌石蜡油30μl覆盖液面，于92℃预变性3min，92℃60s、56℃60s、72℃60s，共30个循环，最后于72℃延伸3min。
2.4.3 扩增产物的鉴定 取扩增产物10μl，进行1%琼脂糖凝胶(含EB)电泳(110V、30 min)，于紫外灯下观察结果并照相。
3 结果
3.1 逆转试验 对照组与实验组K-B纸片扩散法对比，五倍子、绿茶、防风、丹皮、黄芩、浙贝组对苯唑西林钠抑菌环直径扩大8-12mm，对头孢唑啉钠抑菌环直径扩大2-8mm，头孢呋辛抑菌环直径扩大2-14mm，头孢噻肟钠抑菌环直径扩大6-16mm，头孢美唑抑菌环直径扩大4-6mm，均由耐药或中敏恢复为敏感；对青霉素抑菌环直径无影响，仍表现为耐药。见下表。
纸片扩散法抑菌环直径(mm)
RS对照组黄芩组浙贝组丹皮组防风组绿茶组五倍子组
苯唑西林钠≤10≥136161418161814
青霉素≤28≥2910101010101010
头孢唑啉钠≤14≥1816221818181824
头孢呋辛≤14≥1818202024322622
头孢噻肟钠≤14≥2314202020302820
头孢美唑≤12≥1612161618161616
3.2 mecA、femA基因检测 MRSA标准菌株、对照组菌株均检测出耐药特异性基因mecA、femA，丹皮、五倍子、防风、黄芩、浙贝、绿茶组未测出femA基因， mecA基因条带显示明显减弱。见下图。
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a.Marker；b.MRSA质控菌株；c.对照组； d.丹皮；e.白果；f.赤芍；g.川芎；h.五倍子；i.防风j.蝉蜕；k.知母；l.白术；m.黄连；n.丹参；o.黄芩；p.浙贝； q.绿茶
4 讨论
敏感金黄色葡萄球菌有4种青霉素结合蛋白PBPs，即PBP1、2、3和4，它们具有合成细菌细胞壁的功能。β-内酰胺类抗生素通过与细菌内膜上PBPs结合，抑制转肽酶的转肽作用，干扰细菌细胞壁的生物合成，导致细菌溶菌死亡，从而达抗菌作用。MRSA对β-内酰胺类抗生素的耐药机制主要有两种：一是可产生β-内酰胺酶,分解β-内酰胺类抗生素, PBPs可正常行使功能,细菌继续生长 ......
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