新疆塔城地区绵羊细粒棘球绦虫基因型研究与发现
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【摘要】 目的 细粒棘球绦虫存在着实质性的基因遗传差异，将影响其对化疗的反应不同及流行病学上的特征不同，从而在基因水平上进行细粒棘球绦虫虫株基因型及其差异研究,对包虫病治疗药物的研制和开发具有重要意义 方法：本研究采用DNA测序法对细粒棘球绦虫基因片段进行序列分析，明确检测到的细粒棘球绦虫的基因型。结果 通过对新疆塔城25例细粒棘球绦虫分离株标本(取自被感染羊)CO1基因序列分析，发现新疆塔城地区羊株主要流行株为Gl型，其中CO1基因片段长度为789bP，并发现一株新的基因型。结论 将所检测到新疆塔城细粒棘球绦虫基因单倍体序列与Genbank中己登录细粒棘球绦虫基因序列进行同源性比较分析，发现变异碱基对，证明新疆细粒棘球绦虫基因序列存在多态性。
【关键词】 新疆塔城； 细粒棘球绦虫；新G1基因型
在不同的地理环境和宿主中，存在细粒棘球绦虫发生变异的多种影响因素，细粒棘球蚴又有广泛的中间宿主适应性[1]细粒棘球绦虫具有基因多态性从而导致致病的多样性。 由于不同虫株基因型对人的感染力对治疗药物的敏感性以及临床表现的不同，因而对细粒棘球绦虫虫株基因型的研究，对疫苗、诊断试剂盒的研制及临床药物的开发具有重要意义。
近年来， 已在基因水平上对细粒棘球绦虫流行病学、致病性、免疫学、遗传学方面的差异开展了广泛研究。Nakao M等[2] 认为细粒棘球绦虫从基因水平分析应分为不同的种株，目前尚需进一步研究证实。细粒棘球绦虫的株间发育差异将影响杀虫剂的治疗效果，同时细粒棘球绦虫的抗原变异也可影响对人体包虫病的监测以及免疫预防。我国西北广大农牧区是包虫病的主要流行区[3] ，新疆地区地理气候具有多样性和存在适合细粒棘球绦虫寄生的多种中间宿主，并与多个国家和省、自治区接壤，存在基因变异的条件。故细粒棘球绦虫可能存在新的虫株(基因型)或变异株，这与新疆细粒棘球绦虫虫株基因型的全面了解及多态性研究与包虫病的致病机制直接相关。
本研究采用核酸序列分析对新疆伊犁地区来源于羊的细粒棘球绦虫的遗传物质进行研究，探讨不同分类水平上的细粒棘球绦虫种群之间的系统发育、进化机制和种群遗传变异及分化，从不同地区上探寻细粒棘球绦虫的变异情况。
1 材料与方法
1.1 引物与主要试剂
表1 PCR引物
Table 1 PCR primers ,annealing temperature and the length of products
1.2 棘球蚴囊标本来源 包囊标本均采自新疆伊犁地区屠宰场。
1.3 细粒棘球绦虫DNA的提取 严格按照DNA提取方法操作，提取后用紫外光下检测DNA浓度及纯度，-20℃保存
1.4 PCR扩增细粒棘球绦虫线粒体DNA 以提取的细粒棘球绦虫DNA为模板，加特异性CO1引物，扩增细粒棘球绦虫CO1基因片段。扩增参数:94℃预变性30s;94℃变性30s;55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环:72℃延伸7min。得到产物后将产物纯化，纯化后的PCR产物用于DNA序列测定。
1.5 测序 将样品寄至北京天根生物科技有限公司测序。 1.6 PCR序列同源性分析 应用DNAman软件对所测得的新疆细粒棘球绦虫COI基因序列进行同源性分析。用Genbank/BLAST功能对序列进行生物信息学分析。应用CLUSTALW法和DNAman软件对所测新疆伊犁细粒棘球绦虫CO1基因序列进行同源性分析，以GenBank中细粒棘球绦虫的CO1基因序列AF297617(GI)、作为标准序列，统计新疆细粒棘球绦虫CO1基因序列变异位点数 。
2 结果
2.1 新疆细粒棘球绦虫PCR扩增结果 以细粒棘球绦虫DNA为模板，用CO1引物进行PCR扩增，可得到大小约873bp的扩增条带，产物的长度与引物设计的预期产物长度一致，且条带清晰，说明PCR产物可信，可用来测序。
M：DNA标志物(DL-2000)
1：阳性对照
2：感染羊肝包虫内囊基因组PCR产物
2.2 新疆细粒棘球绦虫分离株的基因型及序列分析 采用DNA测序法对新疆伊犁细粒棘球绦虫mtDNACO1基因片段进行序列分析，测定的CO1基因片段长度为789bp。通过对31例细粒棘球绦虫分离株CO1基因序列分析，发现均为Gl基因型，但各序列间有差异。以GenBank中细粒棘球绦虫的CO1基因序列AF297617(G1)为标准序列作对比，同源性为99.3%-100%。
其中1个Gl型基因单倍体Genbank未找到相同变异序列，是新发现的细粒棘球绦虫基因序列。新发现的G1基因变异位点如下：
3 讨论
细粒棘球绦虫虫株通过DNA序列分析可以研究生物的进化过程，显示种间和种内的亲缘关系[4] 。DNA序列分析是鉴定生物不同种、亚种和地理株最直接的方法，还可避免由于环境变异和宿主诱导的修饰及翻译后修饰所造成的影响。线粒体DNA适于种下水平分类研究。其中细胞色素c氧化酶普遍存在于各种原核生物和真核生物细胞的线粒体中，可用来比较其在进化上的相互关系。本次研究选取细胞色素C氧化酶亚单位 l(CO1)基因作为分子标记进行研究。本研究观察了新疆绵羊细粒棘球绦虫CO1基因序列，发现在新疆绵羊中主要存在 G1基因型， Gl型分离株序列同源性为99.3%-100%。并发现1个Gl型基因单倍体在Genbank中未找到相同变异序列，证明是新发现的基因序列。本研究表明，新疆细粒棘球绦虫具有丰富的遗传多态性。对掌握细粒棘球绦虫的分子生物学特征、寻找和追踪传染源、分析棘球绦虫进化史、确定棘球绦虫的致病性、指导临床治疗和制订包虫病防治措施具有重要意义。
参考文献
[1] Eckert J，Deplazes P，Craig PS，et al.Echinococcosis in animals:clinical aspects，diagnosis and treatment[R] ......
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