肝细胞生长因子对结缔组织生长因子刺激下肾小管上皮间质纤维化的影响
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【摘要】 目的 探讨重组人肝细胞生长因子(rhHGF)对结缔组织生长因子(CTGF)刺激下肾小管上皮间质纤维化的影响的影响。方法 体外培养人肾小管上皮细胞(HKC)，在CTGF培养的HKC中加入不同浓度rhHGF分别刺激96小时，提取细胞总RNA，运用RT-PCR技术检测纤维化指标IV型胶原(COL4A1)、纤连蛋白(FN)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)等的基因表达；并以Western印迹法检测α-SMA的蛋白表达改变。结果 rhCTGF加rhHGF组纤维化指标FN和α-SMA表达均较rhCTGF组明显下降(P < 0.01)。结论 HGF可抑制CTGF所致HKC间质纤维化。
【关键词】 肝细胞生长因子；IV型胶原；纤维连接蛋白；α平滑肌肌动蛋白
结缔组织生长因子(CTGF)作为TGF-β的下游效应介质，在高糖血症 — 转化生长因子β(TGF-β)— CTGF —肾间质纤维化模式中起着重要的作用。而阻断CTGF导致的肾小管间质纤维化将有效延缓糖尿病肾病的发展。
晚近的研究表明[1]，肝细胞生长因子(HGF)在糖尿病肾病发展过程中存在着潜在的治疗作用。而目前，多数研究均着重于HGF阻断TGF-β所致的肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞纤维化，但对于CTGF在阻断上述过程中的作用并不明确。本实验先前的研究表明HGF对CTGF的表达有抑制作用，如能证明其对CTGF所致肾小管上皮细胞纤维化过程亦有阻断作用将进一步为HGF治疗糖尿病肾病提供有效证据。
本试验将通过观测rhHGF对CTGF刺激下肾小管上皮间质纤维化的影响来进一步探讨HGF在此过程中的具体作用。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞培养试剂 HKC细胞株，重组人HGF(rhHGF，Peprotech公司，美国)和重组人CTGF(rhCTGF，Peprotech公司，美国)。
1.1.2 RT-PCR试剂 Trizol (Gibco，美国)，逆转录试剂盒(Promega，美国)，PCR 试剂盒(Promega，美国)，聚合酶链反应引物(英骏生物技术，中国)。
1.1.3 Western印迹法试剂 分光光度仪(Pharmacia Biotech，美国)，垂直电泳仪(BioLabs，美国)，PVDF印迹膜(Millipore，美国)，ECL发光反应系统(Cell Signaling，美国)，鼠抗人α-SMA单克隆抗体(Santa Cruz，美国)，鼠抗人GAPDH单克隆抗体(Santa Cruz，美国)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(Santa Cruz，美国)。
1.2 方法
1.2.1 人肾小管上皮细胞株(HKC)培养：HKC用含10%FCS的DMEM/F12培养液传代培养，培养条件为37℃，5%CO2。 0.25%胰蛋白酶消化细胞后，以1×106/瓶的密度接种于25ml培养瓶。用10%FCS- DMEM/F12培养细胞6小时后，以无血清培养基培养12h，使细胞同步于静止期。
HKC孵育18h后，吸弃培养液，分三组：① 换以新鲜DMEM/F12营养液(葡萄糖终浓度为5.5mmol/L)，继续培养78小时；② 换以含CTGF营养液，终浓度为5.0ng/ml，继续培养78小时。③ 换以含CTGF营养液，终浓度为5.0ng/ml，同时加入rhHGF终浓度浓度分别为50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml，继续培养78小时。
1.2.2 COLA41、FN、α-SMA、CTGF 及TGF-β mRNA检测RT-PCR 按Trizol说明书在培养瓶提取细胞RNA，定量后取总RNA2ug作逆转录，步骤参照试剂盒说明书。取1ul逆转录产物为模板，以50ul反应体系进行PCR扩增。取PCR产物5ul在2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察结果并照相，用计算机图像处理系统处理，以吸光度代表表达量，计算上述产物的相对表达量(即各基因条带吸光度/β-actin基因条带吸光度)。至少重复6次独立的RT-PCR全过程。
Western印迹 ① SDS-PAGE：分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%的垂直电泳。样品中加入上样缓冲液，加热变性，恒压120V，电泳7～8小时。② 转膜：采用电转移装置，将电泳后凝胶上的血清成分转移到硝酸纤维素膜上，恒流100A，8小时。③ 蛋白印迹反应：杂交反应液置4℃，反应12小时。去离子水漂洗膜后，反贴法覆于混合液滴上孵育5分钟，在暗室内胶片感光60秒，显影1.5分钟，定影2分钟，清水冲净晾干，结果用数码成像系统扫描，测定光密度值并计算α-SMA与GAPDH光密度比值。
1.2.3 统计学处理 数据用均数±标准差(χ±s)表示。组间差异采用方差分析，由SPSS 10.0统计软件进行统计学处理。
2 结果
2.1 rhHGF对CTGF刺激下HKC FN和α-SMA基因表达的影响(采用半定量RT-PCR法)
如图1所示：rhHGF浓度分别为25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml，与单纯CTGF组比较，FN和α-SMA表达均明显减少，且其表达量呈剂量依赖性。(P < 0.01)
表1：rhHGF对rhCTGF刺激下HKC FN和α-SMA基因表达的影响
与rhCTGF组，* < 0.01；与rhCTGF+小剂量 rhHGF组比较，**P < 0.05
2.2 rhHGF对rhCTGF刺激下HKC α-SMA 蛋白表达的影响 如图2所示：rhHGF浓度分别为25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml，与单纯CTGF组比较，α-SMA蛋白表达量明显减少，且其表达量呈剂量依赖性。
图2：rhHGF对rhCTGF刺激下α-SMA蛋白表达的影响
与对照组比较，*P < 0.01
3 讨论
CTGF属于CCN(包括Cyr61/Cef10, NOV和ELM-1)家族，富含半胱氨酸，为36-38kDa的单体分泌蛋白，其编码基因位于染色体6q23。血清生长因子、TGF-β1、骨形成蛋白、糖皮质激素、纤维蛋白酶等均可激活其表达[2]。目前，对CTGF的生理功能尚未完全清楚[3]，晚近的研究提示[4]，CTGF作为TGF-β的下游效应介质，可以介导TGF-β的负面效应，被认为糖尿病肾病发生与进展的关键因子。
本研究发现，加入rhHGF后，CTGF刺激下FN、α-SMA表达均明显下调，提示HGF可抑制CTGF所致HKC纤维化；同时，不同剂量HGF对纤维化因子表达量的影响，反映了HGF抑制HKC纤维化过程是剂量依赖性的；而rhHGF可在不影响CTGF表达的情况下，抑制后者所致纤维化，表明HGF亦可能通过阻断CTGF的致纤维化途径而发挥作用，但具体机制仍不明确；对比本实验第二部分结果 ......
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