维生素C、白藜芦醇和大黄素对幽门螺杆菌体外抗菌作用的研究
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【摘要】 目的： 评价维生素C、白藜芦醇和大黄素对幽门螺杆菌(Hp)的抑制作用，以及它们与抗生素的联合抑菌作用。方法：检测上述三种物质对Hp的最小抑菌浓度(MIC)；分别将它们和抗生素混合，比较单一药物与混合溶液对耐药菌株的抑菌率。结果：1、维生素C的MIC50为1000mg/L，MIC90为2000mg/L；白藜芦醇的MIC50为62.5mg/L，MIC90为250mg/L；大黄素的MIC50为0.5mg/L，MIC90为2mg/L。2、白藜芦醇与甲硝唑、大黄素与克拉霉素的联合抑菌率比其单独抑菌率要高，其差异均有统计学意义(P<0.0125)。结论：维生素C、白藜芦醇和大黄素在体外对Hp都有抑制作用；白藜芦醇与甲硝唑、大黄素与克拉霉素有协同抗Hp的作用。
【关键词】 幽门螺杆菌；维生素C；白藜芦醇；大黄素
引言
幽门螺杆菌(Hp)是胃十二指肠溃疡、慢性活动性胃炎的主要病因，并与粘膜相关性淋巴组织(MALT)淋巴瘤及胃癌的关系密切。由于抗生素的广泛使用，Hp对抗生素耐药的问题日益严重，严重影响其根除治疗的疗效。本研究通过对维生素C、白藜芦醇及大黄素的体外抗Hp作用的研究，探索新的理想的中西医结合的根除Hp疗法。
1 材料和方法
1.1 研究对象 2005年10月～2009年5月成功培养102例Hp，慢性浅表性胃炎36例，慢性萎缩性胃炎36例，胃溃疡8例，十二指肠溃疡20例，胃癌2例；年龄为16～78岁；男性55例，女性47例。
1.2 实验方法
1.2.1 琼脂稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)，判定耐药菌株(甲硝唑≥8mg/L,克拉霉素≥1mg/L,阿莫西林≥0.5mg/L)。
1.2.2 测定对维生素C、白藜芦醇和大黄素的MIC值。
1.2.3 与抗生素的联合抑菌作用 将1/2MIC50的维生素C、白藜芦醇、大黄素和8mg/L的甲硝唑或1mg/L的克拉霉素按1:1混合，比较混合溶液与单一药物的抑菌率。
1.3 统计方法 应用SPSS11.0软件进行数据的统计学处理，χ2检验及χ2分割检验方法，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Hp对三种抗生素的耐药率 对甲硝唑、克拉霉素及大黄素的耐药率分别为55.88%、22.55%、1.96%。
2.2 抗生素耐药与患者性别、年龄及所患疾病的关系 结果显示：甲硝唑的耐药率与性别、年龄有关，即女性高于男性(56.1%/43.9%)，年龄小的患者高于年龄大的患者，31～50岁组与≥51岁组(63.2%/12.9%)。
2.3 维生素C、白藜芦醇和大黄素的药敏试验 维生素C、白藜芦醇和大黄素对Hp的MIC50及MIC90分别为1000mg/L、2000mg/L；62.5mg/L，250mg/L；0.5mg/L，2mg/L。
2.4 联合抑菌试验 见表1及表2。结果显示：白藜芦醇与甲硝唑的联合抑菌率比其单独抑菌率要高，大黄素与克拉霉素的联合抑菌率比其单独抑菌率要高，差异均有统计学意义(χ2值分别为6.660及6.514、17.899及12.788，P<0.0125)。
表1 各组对甲硝唑耐药菌株的抑菌率(%)
表2 各组对克拉霉素耐药菌株的抑菌率(%)
3 讨论
全国自然人群的Hp感染流行病学调查表明我国Hp感染率平均为59%，因此，对Hp感染的治疗也越来越广泛。但Hp的首治根除率只有约70-80%，导致Hp根除治疗失败的最主要原因是抗生素的耐药。
根除Hp的抗生素中最常用的是甲硝唑、克拉霉素和阿莫西林，其耐药情况日趋严重。全国流行病学调查【1】示甲硝唑的耐药率为50～100%。本研究显示福建地区Hp对甲硝唑的耐药率为55.88%，比2003年的34%升高。根据Maastricht-3共识意见，在甲硝唑耐药率>40%的地区应优先选择PPI联合阿莫西林和克拉霉素的三联疗法作为一线方案，或者考虑采用呋喃唑酮来代替甲硝唑。各国报道克拉霉素的原发耐药率从2%到41.9%不等，有逐年升高的趋势。研究【2】显示克拉霉素的获得耐药率很高，首治失败患者的耐药率高于原发耐药率，既往有大环内脂类药物应用史的Hp感染者，其克拉霉素耐药率可达到30%。本研究显示对克拉霉素的耐药率为22.55%，而且87%合并甲硝唑耐药，这种双重耐药菌株很难根除。有研究表明根除失败的患者中有87%感染的是双重耐药菌株。Hp对阿莫西林的耐药很少见，各地的耐药率介于0%～5%之间，但有研究显示MIC值介于0.04～1mg/L的Hp菌株逐年增多，提示未来对阿莫西林耐药的Hp会越来越多。本研究显示Hp对阿莫西林的耐药率为1.96%，但是它们也同时对甲硝唑和克拉霉素耐药。虽然对阿莫西林的耐药菌株很少，但存在高度耐药及多重耐药菌株，值得临床上的重视和进一步研究。
耐药危险因素的分析主要有性别、年龄、所患疾病及种族等，各地研究报道不尽相同。美国的荟萃研究发现女性、年老的患者、非活动性溃疡的患者对克拉霉素的耐药率较高，年轻的患者对甲硝唑的耐药率较高。本研究的结果显示：女性及年龄在31～50岁的患者对甲硝唑的耐药率较高。甲硝唑耐药与性别有关，考虑是女性患者使用甲硝唑治疗生殖道感染的机会大于男性患者。抗生素耐药与年龄有关，即年轻的患者甲硝唑耐药率较高而年老的患者克拉霉素耐药率较高，这可能与不同抗生素治疗不同疾病有关：甲硝唑常用于治疗妇科疾病，后者多见于年轻女性，克拉霉素常用于治疗呼吸道疾病，后者多见于老年患者。
研究证实维生素C对Hp有直接抑制作用，并且此种抑制作用依赖于培养基中的pH 值。动物实验表明用维生素C治疗的沙土鼠胃内Hp菌落比对照组少得多。Jarosz的临床试验显示，服用维生素C的实验组有8例Hp得到根除，而对照组没有Hp的根除。Yoshinaga的研究显示维生素可提高治疗Hp相关性胃炎的疗效。维生素C对Hp的抑菌作用机制不清，研究提示维生素C可能干扰了Hp的生化机制从而抑制其生长，由于维生素E没有抗Hp作用，可排除维生素C通过非特异性抗氧化剂和清除氧自由基的途径抗Hp，而是自身具有抗Hp作用。
ProtykinR—一种从虎杖中提取的白藜芦醇和大黄素组成的新型药物，研究【3】发现其具有体外抗Hp的作用。国外研究证实了白藜芦醇具有抗Hp的作用，在体外可抑制cagA+菌株的生长，对vac A蛋白也有抑制作用。Wang HH的研究显示大黄素有抑制Hp生长的作用，而且剂量越高对Hp的抑制作用就越强；苟奎斌提取大黄中的4种蒽醌类化合物进行抑制Hp的实验,结果大黄素的抑菌作用最强。大黄素的抗菌作用可能与其抑制细菌核酸的生物合成和呼吸过程有关，大黄素能引起HpDNA的损伤，产生更小的DNA片段。
研究【2】显示克拉霉素可提高维生素C对Hp的抑菌率，而与Protykin也有联合抑菌作用。本研究提示白藜芦醇和甲硝唑、大黄素与克拉霉素有协同抗Hp的作用，其机制尚不明。维生素C在提高耐药菌株对抗生素敏感性方面的作用并不显著，通过抑菌率的比较分析，显示抑菌率的提高主要还是维生素C的作用 ......
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