微小RNA在心血管疾病中的研究进展(1)
【摘要】 微小RNA(microRNA )是一类高度保守的非编码小RNA。它通过降解miRNA或抑制蛋白质翻译而调控基因的表达。最新研究表明，microRNA 在心血管病理、生理过程中起者十分重要的调控作用。它参与了心脏发育、心脏重构、心律失常、血管病变等过程。现就microRNA的生物发生、作用机制及其在心肌肥厚、心力衰竭、心肌损伤、凋亡、心律失常、血管病变中相关作用的研究进展作一综述。
【关键词】 microRNA；心肌肥厚；心肌损伤；凋亡；心律失常
microRNA(miRNA)是一类在生物进化过程中高度保守的非编码小分子 RNA，通过识别靶基因mRNA分子3＇末端翻译区域特异性结合, 负性调控靶mRNA翻译，是一类非常重要的转录后调控因子，在心血管疾病发生发展过程中起到十分重要的调控作用。近年来在研究miRNA在心肌肥厚、心力衰竭、心肌损伤、凋亡、心律失常、血管病变等疾病的作用机制方面取得了一系列进展，使其成为国际心血管研究领域的热点。
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1 microRNA生成及其作用机制
1.1 microRNA生成 1993年Lee等在秀丽新小杆线虫(Cae2norhabditis elegans )中发现了第一个 miRNA,并命名为lin-4。2000年Reinhart等在对线虫发育调控研究中发现了let-7,从而拉开了miRNA研究的序幕。在细胞核内编码miRNA的基因通过RNA聚合酶Ⅱ的作用转录生成 miRNA的原始转录产物pri-miRNA , pri-miRNA在双链RNA特异的核酸酶-Drosha酶的作用下, 被剪切为长约 70-90个核苷酸长度具有发夹型结构的前体miRNA( pre-miRNA )。pre-miRNA在 Ran-GTP 和转运蛋白 Exportin 5的协同作用下转运到胞浆中，并在Dicer酶的作用下被剪切成 21-25个核苷酸的双链mi-RNA。随后双链解旋, 其中一条链被降解，另一条则成为成熟miRNA。成熟miRNA以不对称方式整合入RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)后形成miRNA复合物(miRISC)。如果miRNA与靶mRNA互补配对后则该复合物降解靶mRNA。若miRNA与靶mRNA不完全互补，则起到封闭mRNA的作用，抑制其翻译过程。
, 百拇医药
1.2 microRNA作用机制 研究表明人类基因组中约有30%基因受miRNA调控，miRNA具有广泛的基因调节功能。每个miRNA可以有多个靶基因 ,而几个 miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达，提示miRNA可能通过多元化途径调控靶基因表达。microRNA之间还可能存在协同、拮抗等相互作用，从而表现出microRNA功能作用多样性。但是在不同的组织中，都有特异的miRNA占主导地位。
2 microRNA检测方法
目前miRNA常用检测方法有：(1)Northern blotting 法：是经典的探针杂交检测法，但特异性和灵敏度不高，只能检测表达量非常大的microRNAs而且不能定量检测，为此发展了用锁核酸(LNA)修饰的杂交探针来取代传统DNA探针技术,使Northern blotting法的检测灵敏度和特异性得到显著改善；(2)实时荧光定量 PCR法(Real-time PCR)：用于基因表达的定量和用 DNA阵列技术检测证实基因的差异表达。具有敏感性高、可定量检测样本，需要量少等优点；(3)微阵列芯片技术(Microarray)：能够同时测定多个样本, 可以实现 miRNA 的高通量分析, 即在一块芯片上同时固定多个与miRNA序列互补的探针, 然后加入经过标记的样本RNA, 杂交后进行信号检测，但需要用其它方法对其结果进行检验。
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3 microRNA与心血管疾病
越来越多研究发现 miRNA在生物发育过程中存在组织特异性表达, 参与形成并维持组织特异性。先后有数十种miRNA在心肌细胞中被鉴定，例如miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-133b、miRNA-195等，它们在心血管系统疾病发生发展过程中起着非常重要的作用。
3.1 microRNA与心肌肥厚及心力衰竭 miRNA是心肌细胞异常增殖生的潜在抑制物或加速剂。特定miRNA表达上调, 抑制心肌细胞异常增殖从而阻止或延缓心脏重构的进程；表达下调, 促进心肌细胞异常增殖, 加速心脏重构。目前已经明确心肌细胞肥大中发挥作用的miRNA主要有miRNA-1、miRNA-133、 miRNA-208、miRNA-195、miRNA-21。
miRNA-208是一种心脏组织特异性表达的miRNA，主要在心脏表达，但在肺脏也有微量表达，在心肌细胞增殖、 纤维化及调节β-心肌肌球蛋白链 (β-myosin heavy chain , β- MHC)表达中发挥作用。miRNA-208由α-心肌肌球蛋白链 (α-myosin heavy chain , α- MHC)基因的27位内含子编码, 后者可以促进心脏收缩蛋白的生成, 调节心肌增生。Thomas E. Callis等人在体内通过调控α- MHC的启动子使 miRNA-208a 过度表达时，心脏出现肥大。在体外使分离的心肌细胞中α- MHC过度表达后，心肌细胞变大。Van Rooij等[1]研究发现miRNA-208可能通过抑制靶基因甲状腺素受体相关蛋白1( THRAP1)而调控β- MHC的表达,发挥抗心肌肥厚、 纤维化和心力衰竭的作用。
, 百拇医药
3.2 microRNA与心肌损伤、心肌凋亡 Yin[2]等研究发现缺血预适应(IPC)处理后miRNA-1、miRNA-21和miRNA-24明显增加，机制类似于延迟缺血预适应，可能是通过上调内皮一氧化氮合酶、热休克蛋白(HSP70)以及热休克基因转录因子1发挥作用。进一步的研究发现小鼠经热休克处理后miRNA-1、miRNA-21和miRNA-24在心脏中显著增高，将分离出的miRNA给非热休克(HS)处理的小鼠注射，促凋亡基因被抑制而抗凋亡基因表达增加，缺血-再灌注损伤后的梗死面积显著减少，说明miRNA在缺血-再灌注损伤中发挥保护作用。
3.3 microRNA与心律失常 心肌细胞内离子通道功能异常可导致心脏冲动的形成或传导异常，从而诱发心律失常。新近研究表明有些心律失常可能与miRNA-1和miRNA133的表达异常有关。MiRNA-1和miRNA-133通过抑制靶基因HCN2/HCN4(超极化激活环化核苷酸调控阳离子通道基因)的表达和功能进而抑制了传导，引起心律失常；并且miRNA-1还可能通过下调KCNJ2和GJA1的表达，KCNJ2编码Kir2.1是负责调节心肌静息膜电位的主要钾离子通道亚单位，GJA1负责心室肌细胞之间的电耦联，故减慢心肌细胞传导和复极化，从而引起QRS波时程延长，Q-T间期延长；或抑制PP2A调节亚基B56α，导致依赖CaMKⅡ的RyR2过度磷酸化，进而促进肌浆网Ca2+释放，导致心律失常。Yang等[3]研究发现miRNA-1在冠状动脉性心脏病患者以及大鼠心梗模型的心脏中表达均明显上调。通过在梗死区域心肌内特异上调或下调miRNA-1的表达发现，miRNA-1的过表达可加重心律失常的发生而人为下调miRNA-1的表达则减轻心梗后心律失常的发生。进一步研究表明，心肌梗死后miRNA-1的过度表达抑制了靶基因KCNJ2(编码钾离子通道主要亚基Kir2.1)和GJA1(编码缝隙连接蛋白Cx43)的表达而引发心律失常。, 百拇医药(万晓群 李卫华)
【关键词】 microRNA；心肌肥厚；心肌损伤；凋亡；心律失常
microRNA(miRNA)是一类在生物进化过程中高度保守的非编码小分子 RNA，通过识别靶基因mRNA分子3＇末端翻译区域特异性结合, 负性调控靶mRNA翻译，是一类非常重要的转录后调控因子，在心血管疾病发生发展过程中起到十分重要的调控作用。近年来在研究miRNA在心肌肥厚、心力衰竭、心肌损伤、凋亡、心律失常、血管病变等疾病的作用机制方面取得了一系列进展，使其成为国际心血管研究领域的热点。
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1 microRNA生成及其作用机制
1.1 microRNA生成 1993年Lee等在秀丽新小杆线虫(Cae2norhabditis elegans )中发现了第一个 miRNA,并命名为lin-4。2000年Reinhart等在对线虫发育调控研究中发现了let-7,从而拉开了miRNA研究的序幕。在细胞核内编码miRNA的基因通过RNA聚合酶Ⅱ的作用转录生成 miRNA的原始转录产物pri-miRNA , pri-miRNA在双链RNA特异的核酸酶-Drosha酶的作用下, 被剪切为长约 70-90个核苷酸长度具有发夹型结构的前体miRNA( pre-miRNA )。pre-miRNA在 Ran-GTP 和转运蛋白 Exportin 5的协同作用下转运到胞浆中，并在Dicer酶的作用下被剪切成 21-25个核苷酸的双链mi-RNA。随后双链解旋, 其中一条链被降解，另一条则成为成熟miRNA。成熟miRNA以不对称方式整合入RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)后形成miRNA复合物(miRISC)。如果miRNA与靶mRNA互补配对后则该复合物降解靶mRNA。若miRNA与靶mRNA不完全互补，则起到封闭mRNA的作用，抑制其翻译过程。
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1.2 microRNA作用机制 研究表明人类基因组中约有30%基因受miRNA调控，miRNA具有广泛的基因调节功能。每个miRNA可以有多个靶基因 ,而几个 miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达，提示miRNA可能通过多元化途径调控靶基因表达。microRNA之间还可能存在协同、拮抗等相互作用，从而表现出microRNA功能作用多样性。但是在不同的组织中，都有特异的miRNA占主导地位。
2 microRNA检测方法
目前miRNA常用检测方法有：(1)Northern blotting 法：是经典的探针杂交检测法，但特异性和灵敏度不高，只能检测表达量非常大的microRNAs而且不能定量检测，为此发展了用锁核酸(LNA)修饰的杂交探针来取代传统DNA探针技术,使Northern blotting法的检测灵敏度和特异性得到显著改善；(2)实时荧光定量 PCR法(Real-time PCR)：用于基因表达的定量和用 DNA阵列技术检测证实基因的差异表达。具有敏感性高、可定量检测样本，需要量少等优点；(3)微阵列芯片技术(Microarray)：能够同时测定多个样本, 可以实现 miRNA 的高通量分析, 即在一块芯片上同时固定多个与miRNA序列互补的探针, 然后加入经过标记的样本RNA, 杂交后进行信号检测，但需要用其它方法对其结果进行检验。
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3 microRNA与心血管疾病
越来越多研究发现 miRNA在生物发育过程中存在组织特异性表达, 参与形成并维持组织特异性。先后有数十种miRNA在心肌细胞中被鉴定，例如miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-133b、miRNA-195等，它们在心血管系统疾病发生发展过程中起着非常重要的作用。
3.1 microRNA与心肌肥厚及心力衰竭 miRNA是心肌细胞异常增殖生的潜在抑制物或加速剂。特定miRNA表达上调, 抑制心肌细胞异常增殖从而阻止或延缓心脏重构的进程；表达下调, 促进心肌细胞异常增殖, 加速心脏重构。目前已经明确心肌细胞肥大中发挥作用的miRNA主要有miRNA-1、miRNA-133、 miRNA-208、miRNA-195、miRNA-21。
miRNA-208是一种心脏组织特异性表达的miRNA，主要在心脏表达，但在肺脏也有微量表达，在心肌细胞增殖、 纤维化及调节β-心肌肌球蛋白链 (β-myosin heavy chain , β- MHC)表达中发挥作用。miRNA-208由α-心肌肌球蛋白链 (α-myosin heavy chain , α- MHC)基因的27位内含子编码, 后者可以促进心脏收缩蛋白的生成, 调节心肌增生。Thomas E. Callis等人在体内通过调控α- MHC的启动子使 miRNA-208a 过度表达时，心脏出现肥大。在体外使分离的心肌细胞中α- MHC过度表达后，心肌细胞变大。Van Rooij等[1]研究发现miRNA-208可能通过抑制靶基因甲状腺素受体相关蛋白1( THRAP1)而调控β- MHC的表达,发挥抗心肌肥厚、 纤维化和心力衰竭的作用。
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3.2 microRNA与心肌损伤、心肌凋亡 Yin[2]等研究发现缺血预适应(IPC)处理后miRNA-1、miRNA-21和miRNA-24明显增加，机制类似于延迟缺血预适应，可能是通过上调内皮一氧化氮合酶、热休克蛋白(HSP70)以及热休克基因转录因子1发挥作用。进一步的研究发现小鼠经热休克处理后miRNA-1、miRNA-21和miRNA-24在心脏中显著增高，将分离出的miRNA给非热休克(HS)处理的小鼠注射，促凋亡基因被抑制而抗凋亡基因表达增加，缺血-再灌注损伤后的梗死面积显著减少，说明miRNA在缺血-再灌注损伤中发挥保护作用。
3.3 microRNA与心律失常 心肌细胞内离子通道功能异常可导致心脏冲动的形成或传导异常，从而诱发心律失常。新近研究表明有些心律失常可能与miRNA-1和miRNA133的表达异常有关。MiRNA-1和miRNA-133通过抑制靶基因HCN2/HCN4(超极化激活环化核苷酸调控阳离子通道基因)的表达和功能进而抑制了传导，引起心律失常；并且miRNA-1还可能通过下调KCNJ2和GJA1的表达，KCNJ2编码Kir2.1是负责调节心肌静息膜电位的主要钾离子通道亚单位，GJA1负责心室肌细胞之间的电耦联，故减慢心肌细胞传导和复极化，从而引起QRS波时程延长，Q-T间期延长；或抑制PP2A调节亚基B56α，导致依赖CaMKⅡ的RyR2过度磷酸化，进而促进肌浆网Ca2+释放，导致心律失常。Yang等[3]研究发现miRNA-1在冠状动脉性心脏病患者以及大鼠心梗模型的心脏中表达均明显上调。通过在梗死区域心肌内特异上调或下调miRNA-1的表达发现，miRNA-1的过表达可加重心律失常的发生而人为下调miRNA-1的表达则减轻心梗后心律失常的发生。进一步研究表明，心肌梗死后miRNA-1的过度表达抑制了靶基因KCNJ2(编码钾离子通道主要亚基Kir2.1)和GJA1(编码缝隙连接蛋白Cx43)的表达而引发心律失常。, 百拇医药(万晓群 李卫华)