香丹骨折端注射促进骨痂生长过程中TGF-β、bFGF的表达及骨密度实验研究(1)
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【摘要】 目的：通过香丹注射液骨折端注射，治疗家兔桡骨中段骨折的实验研究，观察转化生长因子-β(TGF-β)、碱性成纤维生长因子(bFGF)，在骨折愈合过程中的表达和分布情况；观察骨密度的测定情况，了解香丹注射液对促进骨折愈合的影响，探讨其作用机制。方法：通过手术造成家兔双侧桡骨中段3mm完全缺损的骨折模型，分设香丹组、空白组、对照组，分别予以香丹注射液、生理盐水骨折端注射、伤科接骨片灌胃。观察转化生长因子-β(TGF-β)、碱性成纤维生长因子(bFGF)，在骨折愈合中的表达和分布特点，证明有调节骨原细胞的增殖和成骨细胞、软骨细胞分化的作用；并从骨密度(BMD)、骨矿含量(BMC)、骨面积(Area)测定等方面进行研究。结果：8天时，香丹组血肿吸收明显，骨折端肿胀明显减轻，改善骨折端血运；TGF-β、bFGF染色呈弱阳性表达。15天时香丹组骨愈合骨密度测定尚无明显优势；TGF-β、bFGF染色呈阳性表达。22天时香丹组和对照组骨愈合情况已无明显差别。31天时骨密度测定香丹组优于对照组，两组均明显优于空白组；香丹组TGF-β、bFGF染色呈强阳性表达。结论：香丹注射液在骨折早中期具有明显促进骨折愈合的作用，其特点是改善骨折局部血循环；通过诱发成骨细胞的活性和增殖，直接刺激膜内成骨，促进细胞分化、成熟，并且激发成骨细胞合成Ⅰ型胶原和骨连接素，加速胶原形成和钙盐沉积，提高骨痂质量，增强骨的强度。
【关键词】 骨折愈合；骨密度；转化生长因子TGF-β；碱性成纤维生长因子bFGF；实验动物；香丹注射液
香丹注射液是心脑血管系统用药，具有良好的改善循环血量的作用，已是临床常用药物，但至今还没有人将它用于骨折端注射以促进骨折生长的报导。本研究从动物实验角度出发，从骨密度测定，骨痂生长过程中转化生长因子-β(TGF-β)、碱性成纤维生长因子(bFGF)，在骨折愈合中的表达和分布情况等方面，初探中药香丹注射液骨折断端注射对骨折愈合的影响及作用机理，为扩大香丹注射液的临床应用范围及给药途径提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物 新西兰大白兔38只，体重2.10±0.39kg，雌雄各半，黑龙江中医药大学动物实验中心提供。
1.2 实验药物 香丹注射液：雅安三九药业有限公司，批号22-5266-川卫药准字(1998)第013660号；伤科接骨片：大连美罗中药厂有限公司，批号国药准字Z21021461；庆大霉素注射液：天津药业集团新郑股份有限公司，批号国药准字H41021258。
主要试剂为TGF-β多克隆抗体、bFGF多克隆抗体、SP试剂盒(北京中山公司)
1.3 实验方法 兔双侧桡骨中段骨缺损动物模型的建立：选用健康体重为2.10±0.39kg，新西兰白兔38只，以20%乌拉坦按3ml/kg耳缘静脉麻醉。先用剪刀剪去双前肢毛后，脱毛处理。术前肌注庆大霉素4万，常规消毒铺巾后，无菌操作下，锐性切开骨膜小心剥离，尽量保留骨膜，使用特定宽度为3mm手锯，将桡骨中段垂直锯断造成3mm缺损，注意防止尺骨损伤，冲洗后严密缝合骨膜、皮肤、骨缺损率为100T。动物清醒后，自由活动。术后庆大霉素4万单位肌注，每日1次，连用3d，术后8d创口愈合。2只创口感染，被剔除，剩36只。
1.4 分组及给药方法 动物完全随机分为三组，每组12只，先用剪刀剪去两侧前臂及腕关节区兔毛后，硫化钠溶液脱毛，以清洁术野，造模后8h，常规消毒，使用细针头，针头大易渗漏，开始于切口旁进针至骨折断端进行药物注射。香丹组——香丹注射液，空白组——生理盐水，对照组——伤科接骨片0.2g/只灌胃，注射剂量均为每只每侧每次0.5ml，每天1次注射剂量根据实验动物因子法计算得到[1]，灌胃剂量由实验动物体表面积计算得到。
2 观察指标及方法
每组分别于术后8d，15d，22d和31d以空气栓塞法各处死3只家兔，进行检查。
2.1 骨密度测定 摄片后，去皮双侧前臂甲醛固定，在哈尔滨市骨伤科医院骨密度测定室进行，采用QDR4500plus型DEXA，以双能X线吸收法，对前臂桡骨中段骨折区作骨密度(BMD)、骨矿含量(BMC)、骨面积(Area)测定，均在骨折部位取一同等条件兴趣区R1，8天、15天、22天和31天四相点检测时仪器设定参数一致，DEXA由微机自动分析打印结果。
结果：骨折兴趣区BMO、BMC、Area测定结果(表1、2、3)
表1 骨折15天BMD、BMC、Area结果比较(X±S)
注：△示与空白组相比P<0.01，#示与香丹组相比P>0.05，统计学处理：行F检验和Q检验，香丹组和对照组均明显优于空白组，香丹组与对照组无明显差别。
表2 骨折22天BMD、BMC、Area结果比较(X±S)
注：△示与空白组相比P<0.01，#示与香丹组相比P>0.05，统计学处理：行F检验和Q检验，香丹组和对照组均明显优于空白组，香丹组与对照组无明显差别。
表3 骨折31天BMD、BMC、Area结果比较(X±S)
注：△示与空白组相比P<0.01，#示与香丹组相比P>0.05，统计学处理：行F检验和Q检验，香丹组优于对照组,香丹组和对照组均明显优于空白组，。
2.2 转化生长因子-β(TGF-β)、碱性成纤维生长因子(bFGF)，在骨折愈合中的表达和分布情况 采用组织学及免疫组织化学染色(SP法)，光学显微镜下观察每一切片中TGF-β、bFGF的表达和分布情况。以平均灰度值作为免疫组化表达程度，选择同一时间段的各组免疫组织化学切片，用HPIAS-1000高清晰度病理图文报告系统，在20×20视野下，同一时间段上各组各随机选择20个视野，对各项检测指标在相关细胞中表达程度进行灰度统计。数据以x-±s表示，用SPSS13.0软件包处理数据，对各时点的灰度值进行t 检验。
2.3 结果
2.3.1 组织学观察
术后8天时骨膜反应增加，骨内膜也有类似的骨膜反应。在肉芽组织中开始有软骨细胞形成。15 天时骨折端骨膜反应停止，骨痂不再增加。软骨组织迅速再生，骨折间隙内也有软骨形成。31 天时软骨大部分已骨化 , 形成桥接骨痂。
2.3.2 免疫组织学观察
2.3.2.1 TGF-β表达：术后8天，骨膜增殖细胞、肉芽组织中的成纤维细胞、内皮细胞和成骨细胞呈阳性表达，而新形成的软骨细胞染色较浅。术后15天，除上述细胞继续呈阳性表达外，软骨细胞以及软骨基质呈明显阳性染色 ......
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