Kai1在皮肤鳞状细胞癌中的表达及意义
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参见附件。
【摘要】目的:探讨Kai1在皮肤鳞状细胞癌(SCC)中的表达及意义。方法:采用免疫组织化学S-P法和核酸分子原位杂交技术分别检测10例正常皮肤、30例皮肤SCC中Kai1、Kai1 mRNA的表达;利用计算机图像分析系统采集、分析图像,并对数据进行统计学处理。 结果:Kai1、Kai1 mRNA在正常皮肤中均呈强阳性或阳性表达,在SCC中均呈弱阳性或阴性表达。两者在SCC中的表达均明显低于正常皮肤,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:Kai1蛋白及其mRNA的低表达可能在皮肤SCC发生、发展的过程中发挥重要作用。
【关键词】Kai1;Kai1 mRNA;鳞状细胞癌
Kail基因是近年来发现的一种新的肿瘤转移抑制基因,主要存在于细胞和其他组织表面,属于跨膜4超家族成员,具有介导细胞与细胞外基质的相互作用,牵涉到细胞融合作用、黏附、迁徙到凋亡、细胞形态学改变的生物学过程,其下调与许多肿瘤发生、发展及转移密切相关。我们采用免疫组织化学、原位杂交技术分别检测Kai1蛋白及其mRNA在皮肤SCC和正常皮肤组织中的表达,探讨Kai1与皮肤SCC发生、发展的关系。
1材料与方法
1.1实验标本标本来源于2006年1月至20010年12月遵义医学院第五附属(珠海)医院和中山大学附属第五医院病理科的存档病例,均经HE染色,光镜观察、确诊。SCC 30例(高分化25 例,中分化4例,低分化1例),其中男24例,女6例;部位:头皮2例,面部14例,下肢7例,阴茎7例;年龄36~84岁,平均63.03岁。患者术前均未行放射治疗和化学治疗。正常皮肤组织10例,取自临床手术切除的带有正常皮肤组织的病变标本。所有蜡块以4μm厚度连续进行切片。
1.2主要试剂兔抗人Kai1多克隆抗体、Kai1 mRNA寡核苷酸探针原位杂交试剂盒,均购自武汉博士德生物工程有限公司。S-P免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。
1.3实验方法
1.3.1免疫组化染色(S-P法) 以前列腺组织为阳性对照,以PBS代替一抗作为阴性对照,Kai1根据产品要求和预试结果确定为1:100,用专用抗体稀释液稀释。切片常规脱蜡至水,微波抗原修复,操作步骤按试剂盒说明书进行,经DAB显色,苏木素复染,脱水、透明,中性树胶封片,显微镜下观察,拍照。
1.3.2原位杂交(ISH)以滴加不含探针的预杂交液作为阴性对照,以前列腺组织为阳性对照,切片经65℃烘烤过夜,操作步骤按原位杂交试剂盒说明书进行,每张切片滴加20μl含Kai1 mRNA寡核苷酸探针的杂交液,40℃杂交过夜,DAB显色,苏木素复染,脱水干燥、透明,中性树胶封片,显微镜下观察,拍照。
1.4免疫标记结果判断Kai1蛋白和Kai1 mRNA以细胞质和细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞。阳性等级判定采用半定量积分法,包括综合染色程度和阳性细胞百分数两个方面,根据每张切片的阳性细胞百分数及着色深浅计分: 在400倍视野下,每张切片随机观察5个不同的视野,每视野计数100个细胞,分别记录每个视野阳性细胞数量并计算其算术平均值:阳性细胞数≤5%为0分,6% ~25%为1分,26%~50%为2分,51% ~75%为3分,>75%为4分; 阳性强度:无着色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。然后根据二者记分相加判断阳性等级:0~1分为阴性,2~3分为弱阳性,4~5分为阳性,6~7分为强阳性。应用显微图像分析系统分别检测阳性染色的表达水平(阳性面积)及其表达强度(光密度)。
1.5统计学方法运用SPSS 13.0 统计软件包,数据均以表示,对结果进行t检验和相关分析,以P<0.05有统计学意义。
2结果
2.1Kai1蛋白和Kai1 mRNA的表达Kai1蛋白和Kai1 mRNA在正常皮肤表皮组织中的表达均呈强阳性或阳性;在SCC组织中的表达分布:在高分化SCC的角化珠中呈阳性,而在其周边的癌细胞以及中分化SCC及低分化SCC中均呈弱阳性或阴性表达(结果如图1-4)。Kai1蛋白和Kai1 mRNA在皮肤SCC中的表达水平和表达强度均明显低于正常皮肤组,差异均有统计学意义(结果如表1)。
表1 Kai1在鳞状细胞癌与正常皮肤中的表达
注:S代表阳性面积代数和/分析区域面积的平均值
G代表光密度
P<0.01
2.2Kai1蛋白和Kai1 mRNA表达的相关性经过相关性分析, Kai1蛋白与Kai1 mRNA在皮肤SCC中的表达成正相关(R=0.751,P<0.05)。
3讨论
皮肤鳞状细胞癌( squamous cell carcinoma,SCC) 是源于上皮组织角质形成细胞的恶性肿瘤,在我国的发病率居皮肤恶性肿瘤之首,占皮肤科恶性肿瘤的78.5%~90.9%[1],并呈上升趋势,其发病机制仍不十分清楚。随着肿瘤分子生物学的研究进展,人们试图从分子水平揭示肿瘤发生发展的机制。目前,已有研究表明:p21、细胞周期蛋白激酶、肝素结合表皮生长因子样生长因子、肿瘤生长抑制因子、IL-1α、HSP27、HSP70、β-连环蛋白等与鳞状细胞癌癌的发生发展相关[2]。至今,尚没有Kai1与皮肤SCC相关性的研究报道。
Kai1基因是Dong[3]等于1995 年首次从人的染色体11p1112中分离出,是新发现的一个肿瘤转移抑制基因。Kail基因编码产物为267个氨基酸组成的蛋白质,具有4 个高度保守的跨膜疏水区域及1 个大的细胞外亲水区域,此亲水区域包含3个潜在N-糖基化位点。Kail蛋白质主要定位于细胞膜表面细胞与细胞连接处。因其在恶性肿瘤发生、发展和侵袭转移中的作用逐步受到广泛重视成为目前研究的热点。Kai1分布极其广泛,机体大多数组织均有表达,它的失活与一些肿瘤的发生发展及浸润有关。研究表明胰腺癌、宫颈癌、肺癌、胃癌、肾癌、口腔癌、甲状腺癌、乳腺癌等肿瘤的进展与Kai1基因表达下降或缺失有明显相关性[4-7],且其表达水平可以作为评价预后的一个重要指标。Kai1在人类侵袭和转移性肿瘤中表达下降,其分子基础尚不明确。有研究报道Kai1其结构为细胞膜糖蛋白,主要影响细胞间及细胞与细胞外基质间的信号传导,参与细胞增生的调节,在多种肿瘤中均有表达下调或缺如,其异常表达与肿瘤的发生发展密切相关。本研究显示,Kai1蛋白及其mRNA在皮肤鳞状细胞癌组织中,染色不均且散在分布,呈弱阳性或阴性表达;而在正常皮肤中染色均匀连续,弥漫分布,呈强阳性或阳性表达。它们在皮肤鳞状细胞癌的表达水平、表达强度均明显低于正常皮肤组织,差异有统计学意义。提示:Kai1蛋白及其mRNA低表达或缺失使细胞间的信号传导异常,从而调节细胞异常增生,可能在皮肤鳞状细胞癌发生发展的过程中发挥重要作用,其具体机制还有待于进一步研究。
参考文献
[1] 赵辨.临床皮肤病学[M].3版.南京:江苏科学技术出版社,2001:1106-1110.
[2] 孙建方.皮肤肿瘤的研究现状及存在问题[J] ......
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