肝癌组织中Sufu\Hip及Cyclin D1的表达及意义(1)
【摘要】目的研究Sufu、Hip、Cyclin D1在肝细胞肝癌及癌旁组织的表达情况，以及它们与肝癌临床病理特征之间的关系，探讨它们之间的相关性。方法采用免疫组化S-P法检测35例肝癌及癌旁病理组织芯片中Sufu,Hip及Cyclin D1蛋白的表达水平。结果35例肝癌组织中Sufu及Hip蛋白阳性表达率明显低于癌旁组织(P<0.05),而Cyclin D1在肝癌组织中阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05); Sufu蛋白在肝癌未合并肝硬化患者中表达率高(5/7,71.43%,P=0.0207),除此之外, Sufu、Hip及Cyclin D1蛋白在肝癌中表达与肿瘤大小、AFP含量、是否合并肝硬化、有无转移及患者年龄等资料无统计学意义( P>0.05)。结论Sufu及Hip为Hedgehog信号通路的两个负性调节基因，参与肝癌的发生和发展；Cyclin D1在肝癌组织中表达增强，反应肝癌细胞增殖，但与Sufu 及 Hip表达不相关。
【关键词】肝细胞癌；Sufu蛋白；Hip蛋白；Cyclin D1蛋白；Hedgehog信号通路
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原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,我国肝癌年死亡率占肿瘤死亡率的第二位。Hedgehog信号通路是一个经典的控制胚胎发育的信号转导途经, 该信号通路控制着细胞的生长与增殖,目前研究发现该信号通路异常激活与肝癌发生有关[1]。本研究采用免疫组化法检测该通路的两个调节基因Sufu、Hip及通路下游Cyclin D1蛋白在肝细胞癌组织和癌旁组织中的表达，以探讨它们与相关临床病理因素之间的关系及Sufu、Hip与Cyclin D1在肝癌组织中表达的相关性。
1资料与方法
1.1 一般资料 选择我院2004年12月～2006年9月35例原发性肝癌组织及距肿瘤边缘2.0cm以上对应癌旁组织, 先制成组织芯片，再分别行HE染色，Sufu、Hip及Cyclin D1免疫组化染色。患者中男性34例,女性1例,年龄在26岁～75岁,中位年龄为51岁。所有病例的临床资料完整，术前均未进行化疗、放疗或免疫治疗,术后病理诊断均为肝细胞癌。
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1.2 试剂与方法 免疫组化采用链霉亲和素-生物素过氧化物酶复合物(S-P)法。Sufu和Hip多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司,工作浓度均为1:200；Cyclin D1单克隆抗体亦为Santa Cruz公司产品，工作浓度为1:50。以高压蒸汽法进行抗原修复,S-P试剂盒为美国ZYMED公司产品。分别以已知Sufu、Hip和Cyclin D1阳性切片作为阳性对照,以PBS液代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判定采用半定量积分法判断结果。免疫组化阳性反应的分级采用兼顾阳性细胞染色强度和阳性细胞所占百分比的判断标准，即每例标本随机检测5个高倍镜视野(×400倍) , 按阳性细胞所占百分比评分：阳性细胞<5%为0分,5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分,>75%为4分。按染色强度评分：不着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。阳性细胞数评分乘以染色强度评分为乘积分数，将乘积分数分为4个等级：0分记为阴性(—)，1至4分记为弱阳性(+),5至8记为阳性(++)，9至12为强阳性(+++)。
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1.4 统计学方法采用统计学软件SAS for windows 9.0。计数资料采用行乘列表的χ2检验、Fisher’s精确概率法,等级资料相关性分析采用Spearman秩相关检验。
2结果
2.1 Sufu、Hip和Cyclin D1在肝癌及肝旁组织表达：Sufu及Hip主要表达于细胞浆，呈棕色或棕黄色颗粒状；二者在肝癌组织中阳性表达率低于癌旁组织(P<0.05，P<0.001)；Cyclin D1主要表达于细胞核,呈棕黄色或棕褐色颗粒状，在肝癌组织中阳性表达率高于癌旁组织(P =0.01)，见表1。
2.2Sufu、Hip和Cyclin D1蛋白表达与肝癌临床病理特征的关系：仅见Sufu蛋白在肝癌合并有肝硬化患者中阳性表达率高(71.43%，P=0.0207)，除此以外，Sufu、Hip和Cyclin D1蛋白在肝癌中表达与患者年龄、AFP含量、肿瘤大小及转移与否、是否合并肝硬化均无相关性(P>0.005)，见表2。
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2.3 肝癌组织中Sufu、Hip和Cyclin D1蛋白表达的相关性：采用Spearman 秩相关检验Hip蛋白与Cyclin D1蛋白表达之间的关系，相关系数=0.23672, P=0.1710>0.05；检验Sufu蛋白与Cyclin D1蛋白表达之间的关系， 相关系数=-0.01144，P =0.9480>0.05，说明35例肝癌组织中Sufu或Hip蛋白表达与下游靶基因Cyclin D1表达不具有相关性。
3 讨论
本研究采用免疫组化方法检测肝癌组织和对应癌旁组织中Sufu、Hip和Cyclin D1蛋白表达情况，结果显示肝癌组织中Sufu及Hip蛋白阳性表达率明显低于癌旁组织，而Cyclin D1蛋白在肝癌组织中阳性表达率明显高于癌旁组织。这提示Sufu及Hip是Hedgehog信号通路的两个负性调节基因，与其它研究所提示Sufu及Hip基因是肿瘤抑制基因相一致[2,3]。Sufu基因编码SHH/PTCH信号通路中一组份，有人检测了9例肺癌组织中Sufu的表达，结果在两例存在SHH通路靶基因表达的组织中，没有检测到Sufu的表达，暗示了Sufu缺失可能是SHH通路激活的原因之一[4]。Barnfield PC[5]等研究发现Sufu抑制转录因子GLI1的活性，并与GLI2，GLI3和丝氨酸-苏氨酸激酶Fu相互作用，Sufu可能通过不同的进出细胞质和细胞核机制来调节GLI1和GLI2，如它依靠出核转运蛋白CRM1使GLI1转移到胞质外；Sufu通过多种机制来阻止GLI1和GLI2在核内累积。这说明Sufu基因可能通过基因突变或缺失及其他机制激活Hedgehog信号通路，并参与肿瘤的发生。本实验还发现Sufu蛋白在没有合并肝硬化HCC中阳性表达率高(71.43%)，而在合并有肝硬化HCC中阳性表达率低(21.44%)，说明该基因可能有抑制肝硬化形成的作用。
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Hip(Hedgehog-interacting protein)是一种糖蛋白，是在脊椎动物中发现HIP基因所编码的一个跨膜蛋白，与HH具有高度亲和性，可以抑制HH结合到其受体上,同时Hip又是Hedgehog信号通路下游的靶基因，因此我们结合Sufu一起对比研究。Jason KS[6]研究发现在正常肝细胞及成熟肝组织中缺少Hedgehog信号通路活性，而在恶性HCC细胞及组织中检测出Hedgehog信号通路活性，发现信号通路各主要成员如SHH，Smo，Gli的基因转录和蛋白表达水平都存在异常升高，而通路的抑制基因如Hip，其表达和转录水平明显降低。认为在正常成熟肝组织中Hedgehog信号通路一般处于抑制状态，而在肝癌中该通路处于活化状态。有人研究发现Hip大量表达于血管内皮细胞，但在其它类型细胞中低表达或不能检测到[7]。认为Hip是HH信号通路的负性调节因子，且Hip低表达促进血管生成。说明Hip基因可能通过促进血管生成等机制参与肝癌发生发展。, http://www.100md.com(何国栋肖忠承周育栀黄纪媛)
【关键词】肝细胞癌；Sufu蛋白；Hip蛋白；Cyclin D1蛋白；Hedgehog信号通路
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原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,我国肝癌年死亡率占肿瘤死亡率的第二位。Hedgehog信号通路是一个经典的控制胚胎发育的信号转导途经, 该信号通路控制着细胞的生长与增殖,目前研究发现该信号通路异常激活与肝癌发生有关[1]。本研究采用免疫组化法检测该通路的两个调节基因Sufu、Hip及通路下游Cyclin D1蛋白在肝细胞癌组织和癌旁组织中的表达，以探讨它们与相关临床病理因素之间的关系及Sufu、Hip与Cyclin D1在肝癌组织中表达的相关性。
1资料与方法
1.1 一般资料 选择我院2004年12月～2006年9月35例原发性肝癌组织及距肿瘤边缘2.0cm以上对应癌旁组织, 先制成组织芯片，再分别行HE染色，Sufu、Hip及Cyclin D1免疫组化染色。患者中男性34例,女性1例,年龄在26岁～75岁,中位年龄为51岁。所有病例的临床资料完整，术前均未进行化疗、放疗或免疫治疗,术后病理诊断均为肝细胞癌。
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1.2 试剂与方法 免疫组化采用链霉亲和素-生物素过氧化物酶复合物(S-P)法。Sufu和Hip多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司,工作浓度均为1:200；Cyclin D1单克隆抗体亦为Santa Cruz公司产品，工作浓度为1:50。以高压蒸汽法进行抗原修复,S-P试剂盒为美国ZYMED公司产品。分别以已知Sufu、Hip和Cyclin D1阳性切片作为阳性对照,以PBS液代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判定采用半定量积分法判断结果。免疫组化阳性反应的分级采用兼顾阳性细胞染色强度和阳性细胞所占百分比的判断标准，即每例标本随机检测5个高倍镜视野(×400倍) , 按阳性细胞所占百分比评分：阳性细胞<5%为0分,5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分,>75%为4分。按染色强度评分：不着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。阳性细胞数评分乘以染色强度评分为乘积分数，将乘积分数分为4个等级：0分记为阴性(—)，1至4分记为弱阳性(+),5至8记为阳性(++)，9至12为强阳性(+++)。
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1.4 统计学方法采用统计学软件SAS for windows 9.0。计数资料采用行乘列表的χ2检验、Fisher’s精确概率法,等级资料相关性分析采用Spearman秩相关检验。
2结果
2.1 Sufu、Hip和Cyclin D1在肝癌及肝旁组织表达：Sufu及Hip主要表达于细胞浆，呈棕色或棕黄色颗粒状；二者在肝癌组织中阳性表达率低于癌旁组织(P<0.05，P<0.001)；Cyclin D1主要表达于细胞核,呈棕黄色或棕褐色颗粒状，在肝癌组织中阳性表达率高于癌旁组织(P =0.01)，见表1。
2.2Sufu、Hip和Cyclin D1蛋白表达与肝癌临床病理特征的关系：仅见Sufu蛋白在肝癌合并有肝硬化患者中阳性表达率高(71.43%，P=0.0207)，除此以外，Sufu、Hip和Cyclin D1蛋白在肝癌中表达与患者年龄、AFP含量、肿瘤大小及转移与否、是否合并肝硬化均无相关性(P>0.005)，见表2。
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2.3 肝癌组织中Sufu、Hip和Cyclin D1蛋白表达的相关性：采用Spearman 秩相关检验Hip蛋白与Cyclin D1蛋白表达之间的关系，相关系数=0.23672, P=0.1710>0.05；检验Sufu蛋白与Cyclin D1蛋白表达之间的关系， 相关系数=-0.01144，P =0.9480>0.05，说明35例肝癌组织中Sufu或Hip蛋白表达与下游靶基因Cyclin D1表达不具有相关性。
3 讨论
本研究采用免疫组化方法检测肝癌组织和对应癌旁组织中Sufu、Hip和Cyclin D1蛋白表达情况，结果显示肝癌组织中Sufu及Hip蛋白阳性表达率明显低于癌旁组织，而Cyclin D1蛋白在肝癌组织中阳性表达率明显高于癌旁组织。这提示Sufu及Hip是Hedgehog信号通路的两个负性调节基因，与其它研究所提示Sufu及Hip基因是肿瘤抑制基因相一致[2,3]。Sufu基因编码SHH/PTCH信号通路中一组份，有人检测了9例肺癌组织中Sufu的表达，结果在两例存在SHH通路靶基因表达的组织中，没有检测到Sufu的表达，暗示了Sufu缺失可能是SHH通路激活的原因之一[4]。Barnfield PC[5]等研究发现Sufu抑制转录因子GLI1的活性，并与GLI2，GLI3和丝氨酸-苏氨酸激酶Fu相互作用，Sufu可能通过不同的进出细胞质和细胞核机制来调节GLI1和GLI2，如它依靠出核转运蛋白CRM1使GLI1转移到胞质外；Sufu通过多种机制来阻止GLI1和GLI2在核内累积。这说明Sufu基因可能通过基因突变或缺失及其他机制激活Hedgehog信号通路，并参与肿瘤的发生。本实验还发现Sufu蛋白在没有合并肝硬化HCC中阳性表达率高(71.43%)，而在合并有肝硬化HCC中阳性表达率低(21.44%)，说明该基因可能有抑制肝硬化形成的作用。
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Hip(Hedgehog-interacting protein)是一种糖蛋白，是在脊椎动物中发现HIP基因所编码的一个跨膜蛋白，与HH具有高度亲和性，可以抑制HH结合到其受体上,同时Hip又是Hedgehog信号通路下游的靶基因，因此我们结合Sufu一起对比研究。Jason KS[6]研究发现在正常肝细胞及成熟肝组织中缺少Hedgehog信号通路活性，而在恶性HCC细胞及组织中检测出Hedgehog信号通路活性，发现信号通路各主要成员如SHH，Smo，Gli的基因转录和蛋白表达水平都存在异常升高，而通路的抑制基因如Hip，其表达和转录水平明显降低。认为在正常成熟肝组织中Hedgehog信号通路一般处于抑制状态，而在肝癌中该通路处于活化状态。有人研究发现Hip大量表达于血管内皮细胞，但在其它类型细胞中低表达或不能检测到[7]。认为Hip是HH信号通路的负性调节因子，且Hip低表达促进血管生成。说明Hip基因可能通过促进血管生成等机制参与肝癌发生发展。, http://www.100md.com(何国栋肖忠承周育栀黄纪媛)