不同浓度枸杞多糖对肾间质纤维化大鼠肾组织TGF-β1的影响(1)
摘要：目的：探究不同浓度枸杞多糖(Lycium Barbarum Polysaccharides，LBP)对肾上皮细胞间质肾纤维化时TGF-β1表达的影响，探讨与分析其对肾纤维化的保护机制。方法：通过单侧输尿管结扎手术(UUO)对40只12周龄雄性大鼠建立肾间质纤维化模型，将其随机分为LBP高剂量(800mg/kg)组、中剂量组(650mg/kg)、低剂量组(450mg/kg)和实验组，每组各10只。实验组采用LBP(空白组用生理盐水)连续灌胃三周。取左肾切片应用HE染色法和Masson三色染色观察组织学变化，取血清用免疫组化法检测各组TGF-β1分布水平。结果：1.实验组肾间质中炎性浸润及肾小管损伤明显，造模成功。2.显示TGF-β1在各肾组织中与对照组相比均下降，以实验组中高剂量组明显。结论：LBP能够降低大鼠血清中TGF-β1的水平，且一定范围内较高者浓度表现明显，故推测LPB可能由此抑制肾间质纤维化进展，对肾纤维化起一定保护作用。
关键词：枸杞多糖;肾间质纤维化;TGF-β1
枸杞的主要有效成分为枸杞多糖，其主要功效为滋补肝肾、益精明日[1]，在临床中主要用于肾虚所致的衰老、生殖功能障碍以及机体免疫力低下[2]。研究证表明LBP还可通过改善肾微循环延缓肾脏衰老改善肾结构，能显著改善衰老肾脏血液循环和肾组织形态，对肾脏具有保护作用[3]。枸杞多糖在临床中预防和治疗慢性肾脏病有重大意义。
近年来慢性肾脏病的发病率越来越高，普遍认为肾间质细胞的纤维化造成的肾脏实质性损伤是导致慢性肾脏病的常见治病因素。Lan等[4]表明TGF-β1是导致进展性肾小管间质纤维化的关键通路。有研究表明，TGF-β1可诱导肌成纤维细胞激活并导致细胞外基质生成，进而导致肾纤维化和肾小管萎缩[5]。同时TGF-β1蛋白可以直接激活一些间质细胞相关基因如波形蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白的表达[6～7]。TGF-β1、smad蛋白介导肾上皮间质细胞的发生和发展，调控肾间质纤维化的进程[8]，导致肾纤维化引起慢性肾疾病。
1材料与方法
1.1动物处理及标本制作
选取SPF12周雄性SD大鼠40只，随机分为一个对照组和三个实验组，每组各10只;实验组高剂量组每天灌胃枸杞多糖800mg/kg/d、中剂量组每天灌胃枸杞多糖650mg/kg/d、低剂量组每天灌胃枸杞多糖450mg/kg/d，對照组灌胃0.9%的生理盐水，维持21d，收集各组大鼠血清取及对各组大鼠左侧肾脏切片。
1.2 HE染色和Masson三色染色形态学观察
取大鼠左侧肾脏进行石蜡标的本制作：肾脏组织经4%多聚甲醛固定后冲洗，再常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋。
1.3血清中TGF-β1的测定
用TGF-β1检测试剂盒用于定量检测血清中TGF-β1的含量，取血清离心20分钟(2000-3000转/分)，收集上清液，每只大鼠血清做5张涂片，在40 倍物镜下随机取10 个不同视野，用Motic Images Advanced 3.2 图像分析系统，测定TGF-β1蛋白阳性反应物相对含量的平均光密度值。
1.4 统计学处理
计量资料用均数±标准差(x ± s)表示，用SPSS17.0 统计软件进行统计分析，计量资料进行正态性检验后进行方差分析，P<0.05 认为差异有统计学意义。
2结果
2.1组织学观察
对照组、实验低剂量组和中剂量组肾小管明显扩张，部分萎缩，间质基质沉淀，实验高剂量组肾小管稍有扩张，部分萎缩，间质基质可见少许沉淀。
2.2血清中TGF-β1测定结果
高中低剂量组中大鼠血清TGF-β1在对照组中均呈阳性反应，尤其以高剂量组为强阳性反应(P<0.05)，将其进行平均光密度统计分析，具体见表1。
表1大鼠血清TGF-β1阳性反应的平均光密度(x ± s)
*高剂量组与对照组中其他细胞比较，P<0.05
3讨论
目前随着慢性肾病的发病率越来越高，研究者对肾纤维化的保护处于热门讨论话题。肾纤维化的发病机制复杂，与多种治病因素有关，作为肾小管纤维化的关键通道TGF-β1，其能诱导细胞因子促进细胞外基质的大量堆积形成肾间质纤维化，最终引起慢性肾衰竭[9-10]。本次研究通过单侧输尿管结扎建立肾纤维化模型，用HE染色法和Masson三色染色常规观察LBP干预后肾脏组织的变化，通过对各组检测TGF-β1的表达进行检测分析.每组均相应的有所下降，尤其以高浓度组为较明显;而从组织学观察来看，高浓度组的肾纤维化相比其他组有明显减轻。故此可推测，LBP在干预肾纤维化对其起到保护作用时，很可能是通过对TGF-β1的表达从来对其起到保护作用。
综上所述，LBP能减轻UUO模型对大鼠肾间质纤维化的影响，其中LBP高剂量的作用效果优于LBP低、中剂量组，且在TGF-β1的阳性表现来看，高浓度组的阳性反应较为强，LBP可调控TGF-β1蛋白在上皮细胞间质转化中的作用，缓解肾间质纤维化的进程，从而为临床预防和治疗慢性肾脏病提供新的科学参考依据。
参考文献：
[1].南亚昀，雍学芳 枸杞多糖药理学研究进展 天津中医药 2014年12月第31卷第12期
[2].马倩倩 枸杞多糖生物活性的研究进展 农产品加工 2017年7月第七期
[3].刘晓梅 陈 尚 枸杞多糖对衰老小鼠肾小球形态学指标的影响 中国老年学杂志 2009;18;2354-2355, http://www.100md.com(杨智麟 陈浩 于皓岚 曾欢奇 杨依婷 唐玮蔚)
关键词：枸杞多糖;肾间质纤维化;TGF-β1
枸杞的主要有效成分为枸杞多糖，其主要功效为滋补肝肾、益精明日[1]，在临床中主要用于肾虚所致的衰老、生殖功能障碍以及机体免疫力低下[2]。研究证表明LBP还可通过改善肾微循环延缓肾脏衰老改善肾结构，能显著改善衰老肾脏血液循环和肾组织形态，对肾脏具有保护作用[3]。枸杞多糖在临床中预防和治疗慢性肾脏病有重大意义。
近年来慢性肾脏病的发病率越来越高，普遍认为肾间质细胞的纤维化造成的肾脏实质性损伤是导致慢性肾脏病的常见治病因素。Lan等[4]表明TGF-β1是导致进展性肾小管间质纤维化的关键通路。有研究表明，TGF-β1可诱导肌成纤维细胞激活并导致细胞外基质生成，进而导致肾纤维化和肾小管萎缩[5]。同时TGF-β1蛋白可以直接激活一些间质细胞相关基因如波形蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白的表达[6～7]。TGF-β1、smad蛋白介导肾上皮间质细胞的发生和发展，调控肾间质纤维化的进程[8]，导致肾纤维化引起慢性肾疾病。
1材料与方法
1.1动物处理及标本制作
选取SPF12周雄性SD大鼠40只，随机分为一个对照组和三个实验组，每组各10只;实验组高剂量组每天灌胃枸杞多糖800mg/kg/d、中剂量组每天灌胃枸杞多糖650mg/kg/d、低剂量组每天灌胃枸杞多糖450mg/kg/d，對照组灌胃0.9%的生理盐水，维持21d，收集各组大鼠血清取及对各组大鼠左侧肾脏切片。
1.2 HE染色和Masson三色染色形态学观察
取大鼠左侧肾脏进行石蜡标的本制作：肾脏组织经4%多聚甲醛固定后冲洗，再常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋。
1.3血清中TGF-β1的测定
用TGF-β1检测试剂盒用于定量检测血清中TGF-β1的含量，取血清离心20分钟(2000-3000转/分)，收集上清液，每只大鼠血清做5张涂片，在40 倍物镜下随机取10 个不同视野，用Motic Images Advanced 3.2 图像分析系统，测定TGF-β1蛋白阳性反应物相对含量的平均光密度值。
1.4 统计学处理
计量资料用均数±标准差(x ± s)表示，用SPSS17.0 统计软件进行统计分析，计量资料进行正态性检验后进行方差分析，P<0.05 认为差异有统计学意义。
2结果
2.1组织学观察
对照组、实验低剂量组和中剂量组肾小管明显扩张，部分萎缩，间质基质沉淀，实验高剂量组肾小管稍有扩张，部分萎缩，间质基质可见少许沉淀。
2.2血清中TGF-β1测定结果
高中低剂量组中大鼠血清TGF-β1在对照组中均呈阳性反应，尤其以高剂量组为强阳性反应(P<0.05)，将其进行平均光密度统计分析，具体见表1。
表1大鼠血清TGF-β1阳性反应的平均光密度(x ± s)
*高剂量组与对照组中其他细胞比较，P<0.05
3讨论
目前随着慢性肾病的发病率越来越高，研究者对肾纤维化的保护处于热门讨论话题。肾纤维化的发病机制复杂，与多种治病因素有关，作为肾小管纤维化的关键通道TGF-β1，其能诱导细胞因子促进细胞外基质的大量堆积形成肾间质纤维化，最终引起慢性肾衰竭[9-10]。本次研究通过单侧输尿管结扎建立肾纤维化模型，用HE染色法和Masson三色染色常规观察LBP干预后肾脏组织的变化，通过对各组检测TGF-β1的表达进行检测分析.每组均相应的有所下降，尤其以高浓度组为较明显;而从组织学观察来看，高浓度组的肾纤维化相比其他组有明显减轻。故此可推测，LBP在干预肾纤维化对其起到保护作用时，很可能是通过对TGF-β1的表达从来对其起到保护作用。
综上所述，LBP能减轻UUO模型对大鼠肾间质纤维化的影响，其中LBP高剂量的作用效果优于LBP低、中剂量组，且在TGF-β1的阳性表现来看，高浓度组的阳性反应较为强，LBP可调控TGF-β1蛋白在上皮细胞间质转化中的作用，缓解肾间质纤维化的进程，从而为临床预防和治疗慢性肾脏病提供新的科学参考依据。
参考文献：
[1].南亚昀，雍学芳 枸杞多糖药理学研究进展 天津中医药 2014年12月第31卷第12期
[2].马倩倩 枸杞多糖生物活性的研究进展 农产品加工 2017年7月第七期
[3].刘晓梅 陈 尚 枸杞多糖对衰老小鼠肾小球形态学指标的影响 中国老年学杂志 2009;18;2354-2355, http://www.100md.com(杨智麟 陈浩 于皓岚 曾欢奇 杨依婷 唐玮蔚)