微管相关Tau蛋白mRNA在胃癌中表达的意义(2)
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参见附件。
1.3.3 反转录过程 在冰浴的管中加入如下组分：RNA 1 000 ng，Oligo(dT)15(0.05μg/μL)1μL，无RNA酶水定容至11μL，轻轻混匀后离心3 s；反应混合物在放于PCR仪中70℃5 min，立即置于冰上，冰浴30 s，离心3 s；在试管中加入如下组分5×Reaction Buffer 4μL，RNase Inhibitor(20 U/μL)1μL，dNTP Mix(10 mmol/L)2μL，混匀，离心，放于PCR仪中37℃，5 min，冰浴30 s，离心3 s；加入AMV RT(10 U/μL)2μL，终体积20μL，放于PCR仪中37℃，60 min；70℃10 min结束反应，置于冰上进行后续实验。
1.3.4 聚合酶链反应(PCR) Tau上游引物(5’to 3’)：GTGACCCAAGAGCCTGAAAGT；Tau下游引物(5’to 3’)：GGTGCAGGTCTCCTAGAAGC；50 bp DNA Ladder购自北京天根生化有限公司(MD108)。冰浴中，在管中加入如下组分：上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，cDNA模板(500 ng-1μg/μL)1μL，加ddH2O至25μL，β-actin循环设置：95℃预变性5 min；95℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72℃延伸30 s，循环31次；72℃最终延伸10 min结束反应。产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
E-cad循环设置：95℃预变性5 min；95℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸30 s，循环40次；72℃最终延伸10 min结束反应。产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
Tau循环设置：95℃预变性5 min；95℃变性45 s ......
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