TIP30基因启动子甲基化与大肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性关系的研究(2)
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1.3.1 细胞处理 将大肠癌HCT116及HT29细胞重悬，接种于6孔板中培养，待细胞处于对数生长期时，分别加入5-aza-2'-deoxycytidine(5-杂氮脱氧胞嘧啶，DAC)，终浓度为10µM/L，隔天更换含相同药物浓度的新鲜RPMI 1640培养液，培养3 d后收集细胞备用。对照组细胞采用相同体积的D-Hanks液处理。
1.3.2 基因组DNA的提取 将细胞清洗后移入离心管，1500 g离心2 min。去上清液后加入400μL lX细胞裂解液摇匀，再加入20 mg/mL蛋白酶K 4μL，50℃培养2 h，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀、溶解。-20℃保存备用。
1.3.3 DNA亚硫酸氢盐处理 1μg模板DNA，补水至20μL，加入3 mol/L NaOH 2.2μL，37℃20 min。加入230μL NH4HSO3后混匀，加石蜡油覆盖液面，90℃30 min。吸去石蜡油，加入500μL溶胶液，混匀后过柱，用漂洗液洗1次。加入0.3 mol/L NaOH (50%乙醇)300μL，室温放置15 min，离心去除废液，漂洗液洗2次，200μL TE洗脱后，-20℃保存备用。
1.3.4 TIP30基因进行CpG岛甲基化状态检测 根据TIP30基因启动子DNA片段设计引物，上游引物为5’ TTTGGGTGAGTTGAGTTTAGTAGG3’；下游引物为5’ TACCACAAACTACTAACATC ACTAAAC 3’。PCR反应体系含处理过的DNA 1μL，10×Buffer 2.5μL，2.5 mmol/L dNTP 2μL，5 mmoL/L上、下游引物各1μL，Blend-plus酶0.5μL。PCR反应条件：95℃3 min；94℃45 s，60℃45 s，72℃45 s，35个循环；72℃ 7 min。PCR产物电泳后，切胶回收，进行T-A克隆，挑取阳性克隆进行测序。
1.4 逆转录PCR检测大肠癌细胞株中TIP30基因的mRNA表达
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