缺氧诱导因子2α和胸苷磷酸化酶在肾透明细胞癌中的表达及意义(1)
[摘要] 目的 探讨肾透明细胞癌中胸苷酸磷酸化酶(TP)和缺氧诱导因子2α(HIF-2α)的表达水平与临床病理指标及预后的关系。 方法 采用免疫组化技术检测43例肾透明细胞癌组织中TP和HIF-2α的表达。 结果 TP和HIF-2α主要表达在肾透明细胞癌肿瘤细胞胞核中。TP在43例肿瘤组织均有表达，TP的表达和肾透明细胞癌的a分期、远处转移和微血管密度有关(P<0.05)，而与淋巴结转移无关(P>0.05)。HIF-2α阳性表达21例，阳性表达率为48.84%。HIF-2α的阳性表达与肾透明细胞癌的远处转移有关(P<0.05)，而与分期、淋巴结转移和微血管密度无关(P>0.05)。TP和HIF-2α表达呈正相关(r=0.837，P<0.001)。 结论 检测TP的表达对肾透明细胞癌患者的预后有指导意义。HIF-2α和TP共同参与了肾透明细胞癌的侵袭和转移。
[关键词] 肾透明细胞癌；缺氧诱导因子2α；胸苷酸磷酸化酶；微血管密度
[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616(2013)18-37-03
新生血管生长是肿瘤生长代谢所必需的一个因素。肿瘤细胞通过直接分泌血管生成因子或通过激活并释放贮存于细胞外基质内的血管生成复合物刺激血管生成。胸苷酸磷酸化酶(thymidine phosphorylase，TP)和缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)在体内显示有重要的新生血管活性。人肾细胞癌(RCC)血运丰富，因此肾细胞癌中一些肿瘤相关的血管生成因子可能参与了肿瘤的生物学行为。本研究通过检测肾透明细胞癌中TP和HIF-2α的表达，研究这两种血管生长因子和临床病理特征以及微血管密度的相关性，以探讨TP和HIF-2α在肾细胞癌侵袭和转移中的作用。
1 材料和方法
1.1 组织标本
取2010～2012年郑州大学第一附属院泌尿外科手术切除的43例肾透明细胞癌组织。其中，男29例，女14例，年龄34～69岁，平均年龄47.2岁。所有组织均经10%的多聚甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片，备用。正常肾组织石蜡标本9例作为对照组。
1.2 主要试剂
即用型鼠抗人TP单克隆抗体，即用型鼠抗人CD34单克隆抗体和鼠抗链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)试剂盒为福州迈新公司产品，浓缩型鼠抗人HIF-2α单克隆抗体(sc-13596)为美国Santa Cruz公司产品。
1.3 实验方法
采用SP免疫组织化学方法，按照说明书程序进行操作。石蜡切片常规脱蜡，脱水，双蒸水冲洗3min，抗原修复采用高压抗原修复法，滴加3%H2O2 20min，后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次3min，加正常封闭血清25min，分别滴
加TP、CD34和HIF-2α(1︰50)一抗，4℃过夜，室温平衡后用PBS冲洗3次，每次3min，再滴加生物素标记的二抗，室温孵育20min，PBS洗3次，每次3min，最后，每张切片加三抗溶液，室温孵育20min，PBS洗3次，每次3min，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染(HIF-2α未复染)，0.1%盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用已知乳腺癌阳性切片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。
1.4 结果判定
采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统(同济医科大学千屏影像工程公司)，检测阳性染色的数量及其平均光密度值(mean optical density，MOD)。TP和HIF-2α阳性染色为棕黄色颗粒，定位于肾癌透明细胞或颗粒细胞胞核。以CD34在200倍镜下检测计算微血管密度(microvessel density，MVD)。评估微血管密度，将CD34染色的切片置于低倍镜下(×40)观察，确认血管数最高的区域。每个肿瘤标本中，选择最高密度的区域在×200高倍镜下计数。伴或不伴有内腔的单个内皮细胞或内皮细胞群均被认为是单独的血管。微血管密度分为3个等级：Ⅰ级，每个视野0～50个微血管，Ⅱ级每个视野51～100个微血管，Ⅲ级，每个视野>100个微血管。
1.5 统计学方法
利用SPSS10.0统计软件包完成统计分析，平均光密度值用()表示。病理指标组间采用两独立样本t检验；微血管密度组间采用单因素方差分析；TP和HIF-2α指标间采用直线相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肾透明细胞癌中MVD
组织切片中内皮细胞均由CD34抗体显示为棕黄色来反映MVD。其中Ⅰ级9例，Ⅱ级15例，Ⅲ级19例。
2.2 TP在肾透明细胞癌中的表达
43例肾透明细胞癌中TP全部有阳性表达，表现为肿瘤细胞胞核呈棕黄色颗粒，部分细胞胞质内也出现棕黄色颗粒，背景和对照组细胞核均未染色。统计学分析显示TP的表达和肾细胞癌的分期、远处转移和微血管密度有关(P<0.05)，而与淋巴结转移无关(P>0.05)。TP在肾透明细胞癌中阳性染色MOD值见表1。
2.3 HIF-2α在肾透明细胞癌中的表达
43例肾透明细胞癌中HIF-2α阳性表达21例，阴性22例，阳性表达率为48.84%。阳性表达表现为肿瘤细胞胞核呈棕黄色颗粒，细胞胞质内未见棕黄色颗粒。对照组细胞核未染色。HIF-2α的阳性表达与肾透明细胞癌的远处转移有关(P<0.05)，而与分期、淋巴结转移和微血管密度无关(P>0.05)。HIF-2α在肾透明细胞癌中阳性染色MOD值见表1。
2.4 肾透明细胞癌中TP表达与HIF-2α表达的关系
43例TP阳性表达标本中HIF-2α阳性表达21例，对比这21例病例中TP和HIF-2α的阳性表达平均光密度值和表达位置发现HIF-2α大片着色的组织同时伴有TP的高表达，两指标阳性表达平均光密度值具有一定线性相关趋势。通过对MOD值的相关分析显示TP和HIF-2α的表达呈正相关(r=0.837，P<0.001)。, http://www.100md.com(李琦)
[关键词] 肾透明细胞癌；缺氧诱导因子2α；胸苷酸磷酸化酶；微血管密度
[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616(2013)18-37-03
新生血管生长是肿瘤生长代谢所必需的一个因素。肿瘤细胞通过直接分泌血管生成因子或通过激活并释放贮存于细胞外基质内的血管生成复合物刺激血管生成。胸苷酸磷酸化酶(thymidine phosphorylase，TP)和缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)在体内显示有重要的新生血管活性。人肾细胞癌(RCC)血运丰富，因此肾细胞癌中一些肿瘤相关的血管生成因子可能参与了肿瘤的生物学行为。本研究通过检测肾透明细胞癌中TP和HIF-2α的表达，研究这两种血管生长因子和临床病理特征以及微血管密度的相关性，以探讨TP和HIF-2α在肾细胞癌侵袭和转移中的作用。
1 材料和方法
1.1 组织标本
取2010～2012年郑州大学第一附属院泌尿外科手术切除的43例肾透明细胞癌组织。其中，男29例，女14例，年龄34～69岁，平均年龄47.2岁。所有组织均经10%的多聚甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片，备用。正常肾组织石蜡标本9例作为对照组。
1.2 主要试剂
即用型鼠抗人TP单克隆抗体，即用型鼠抗人CD34单克隆抗体和鼠抗链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)试剂盒为福州迈新公司产品，浓缩型鼠抗人HIF-2α单克隆抗体(sc-13596)为美国Santa Cruz公司产品。
1.3 实验方法
采用SP免疫组织化学方法，按照说明书程序进行操作。石蜡切片常规脱蜡，脱水，双蒸水冲洗3min，抗原修复采用高压抗原修复法，滴加3%H2O2 20min，后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次3min，加正常封闭血清25min，分别滴
加TP、CD34和HIF-2α(1︰50)一抗，4℃过夜，室温平衡后用PBS冲洗3次，每次3min，再滴加生物素标记的二抗，室温孵育20min，PBS洗3次，每次3min，最后，每张切片加三抗溶液，室温孵育20min，PBS洗3次，每次3min，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染(HIF-2α未复染)，0.1%盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用已知乳腺癌阳性切片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。
1.4 结果判定
采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统(同济医科大学千屏影像工程公司)，检测阳性染色的数量及其平均光密度值(mean optical density，MOD)。TP和HIF-2α阳性染色为棕黄色颗粒，定位于肾癌透明细胞或颗粒细胞胞核。以CD34在200倍镜下检测计算微血管密度(microvessel density，MVD)。评估微血管密度，将CD34染色的切片置于低倍镜下(×40)观察，确认血管数最高的区域。每个肿瘤标本中，选择最高密度的区域在×200高倍镜下计数。伴或不伴有内腔的单个内皮细胞或内皮细胞群均被认为是单独的血管。微血管密度分为3个等级：Ⅰ级，每个视野0～50个微血管，Ⅱ级每个视野51～100个微血管，Ⅲ级，每个视野>100个微血管。
1.5 统计学方法
利用SPSS10.0统计软件包完成统计分析，平均光密度值用()表示。病理指标组间采用两独立样本t检验；微血管密度组间采用单因素方差分析；TP和HIF-2α指标间采用直线相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肾透明细胞癌中MVD
组织切片中内皮细胞均由CD34抗体显示为棕黄色来反映MVD。其中Ⅰ级9例，Ⅱ级15例，Ⅲ级19例。
2.2 TP在肾透明细胞癌中的表达
43例肾透明细胞癌中TP全部有阳性表达，表现为肿瘤细胞胞核呈棕黄色颗粒，部分细胞胞质内也出现棕黄色颗粒，背景和对照组细胞核均未染色。统计学分析显示TP的表达和肾细胞癌的分期、远处转移和微血管密度有关(P<0.05)，而与淋巴结转移无关(P>0.05)。TP在肾透明细胞癌中阳性染色MOD值见表1。
2.3 HIF-2α在肾透明细胞癌中的表达
43例肾透明细胞癌中HIF-2α阳性表达21例，阴性22例，阳性表达率为48.84%。阳性表达表现为肿瘤细胞胞核呈棕黄色颗粒，细胞胞质内未见棕黄色颗粒。对照组细胞核未染色。HIF-2α的阳性表达与肾透明细胞癌的远处转移有关(P<0.05)，而与分期、淋巴结转移和微血管密度无关(P>0.05)。HIF-2α在肾透明细胞癌中阳性染色MOD值见表1。
2.4 肾透明细胞癌中TP表达与HIF-2α表达的关系
43例TP阳性表达标本中HIF-2α阳性表达21例，对比这21例病例中TP和HIF-2α的阳性表达平均光密度值和表达位置发现HIF-2α大片着色的组织同时伴有TP的高表达，两指标阳性表达平均光密度值具有一定线性相关趋势。通过对MOD值的相关分析显示TP和HIF-2α的表达呈正相关(r=0.837，P<0.001)。, http://www.100md.com(李琦)