非毒性结节性甲状腺肿蛋白质表达差异的初步研究(2)
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1.2.2 蛋白样本制备 取超低温保存的组织标本100mg 加入液氮后研磨成粉，加入裂解液0.8mL(配方：1mmol/L PMSF，2mol/L Thiourea，2%CHAPs(W/V)，20mmol/L Tris，7mol/L Urea，加适量HCl 配成pH=8.5的溶液)，溶解充分后移至1.5mL EP管，超声助溶(80W，0.7s，间隔0.8s，11次)，上清液4℃，150 000×g 超速离心45min，小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃ 40 000×g 再次离心50min。Bradford 法定量，分装后置-75℃保存。
1.2.3 双向电泳 分析型凝胶，上样量300μg；制备型凝胶，上样量1200μg。参考IPGphorTM进行第一向电泳等点聚焦：在PGPHOR3等电聚焦仪上进行，程序：20℃，电流50μA/胶，200V 1h，500V 1h，1000V 1.5h，8000V 5h。胶条平衡后，参考Etten Dalt IITM指南进行第二向电泳SDSPAGE(5W/gel 45min，20W/gel 6h)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即停止电泳。
1.2.4 凝胶染色 分析型凝胶用银染试剂盒进行硝酸银染色；制备型凝胶用考马斯亮蓝G-250染色，每种液体用量为250mL/胶，所有步骤均在摇床上进行。
1.2.5 凝胶的扫描及质谱分析 对双向电泳染色后的凝胶经256灰阶模式扫描 ......
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