真核表达载体pEGFP—N1—kin17的构建及其在Zmpste24—/—小鼠胚胎成纤维细胞内的表达(2)
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1 材料与方法
1.1 MEFs分离和传代
孕13.5 Zmpste24+/-雌小鼠由香港大学周中军教授馈赠。实施断颈法处死孕小鼠，无菌条件下取出小鼠胚囊，逐一分离，置于3.5cm的培养皿中。除去胚胎头部及内脏组织后(收取部分做基因型鉴定)，每个胚胎加入1mL胰蛋白酶-EDTA后用眼科剪将组织剪碎，并在37℃孵育约15min。随后将细胞组织悬液转移至一个15cm培养皿中，加入20mL含10%胎牛血清的DMEM培养液，终止胰酶消化，在培养箱中过夜培养，次日更换培养基。细胞长到80%～90%汇合时并仍处于指数生长期时，冻存细胞或将细胞传代。传代时弃去培养液，PBS缓冲液清洗细胞，1mL 5%胰酶-EDTA 37℃消化5min。随后加入上述DMEM培养液5mL，轻轻吹打细胞，使细胞脱离培养皿表面，离心回收细胞后，可根据实验将细胞1︰3至1︰5稀释移至新的培养皿中，或用血球计数板计数，接种相应的细胞数量至实验所需的不同的细胞培养皿中，加入适量培养液在37℃ 5%CO2培养箱培养。
1.2 MEFs基因型鉴定
1.2.1 基因水平鉴定方法 PBND法[50mM KCl，10mM Tris-HCL(pH8.3)， 2.5mM MgCl2， 0.1mg/mL gelatin， 0.45%(v/v) Nonident P40，0.45%(v/v) Tween 20]溶解收取的部分小鼠胚胎组织，加入蛋白酶K(20mg/mL)，55℃过夜。次日沸水煮样本5min，离心取上清1～5?L作为PCR模板。PCR引物：共同上游引物GTCTCCTCGTGATGTCACAACTTTG ......
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