替格瑞洛原料中甲酸含量的检查
[摘要]目的运用高效液相色谱法测定替格瑞洛原料药中甲酸的含量。方法采用Welch Ultimate AQ-Cls色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；以pH=2.5磷酸缓冲液及乙腈为流动相，进行梯度洗脱；流速1.0mL/min；检测波长210nm；柱温30℃。结果甲酸在10.06～70.39μg/mL浓度范围内，浓度和峰面积线性关系良好，线性方程：Y=2.88×10X(过原点)，r=0.9957；回收率平均值为98.7%，RSD为0.73%。结论该方法可行，对替格瑞洛原料的质量控制有一定的意义。
[关键词]高效液相色谱法；梯度洗脱；替格瑞洛；甲酸
替格瑞洛是首个可逆的结合型P2Y12腺苷二磷酸受体(ADP)拮抗剂，能可逆性地作用于血管平滑肌细胞上的嘌呤2受体亚型P2Y12，对ADP引起的血小板聚集有明显的抑制作用，能有效改善急性冠心病患者的症状，已被证明比Plavix更有效，是第一个证实能减少急性冠脉综合征所有类型的心血管死亡的抗血小板药物。我司的替格瑞洛合成工艺中使用了甲酸溶剂。甲酸为第三类溶剂，根据药典要求，需限制使用，中国药典规定其限度为0.5%。为保证我司替格瑞洛的产品质量，建立了液相分析方法对残留的甲酸含量进行检测，并对该方法进行了方法学验证，确保检测结果的准确可靠。
1仪器与试药
Dionex UltiMate 3000高效液相色谱仪；Chromeleon 7工作站；德国赛多利斯BP211D型电子天平。
替格瑞洛样品(珠海保税区丽珠合成制药有限公司，批号为1403001、1403002、1404001)；甲酸对照品(色谱纯，Fisher)；注射用水；磷酸二氢钠(分析纯，广州化学试剂二厂)；磷酸(分析纯，广州化学试剂厂)。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱为Welch Ultimate AQ-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱温为30℃；流动相A为磷酸缓冲液(50mmol/L的磷酸二氢钠，磷酸调pH值至2.5)；流动相B为乙腈；流速为1.0mL/min；检测波长为210mm；进样量为5μL，按表1采用梯度方式进行洗脱。
2.2溶液制备
取甲酸适量，精密称定，加20%乙腈溶解并定量稀释成每1mL约含50μg甲酸的溶液，加20%乙腈定容至刻度，即得对照品溶液(约50μg/mL)。取本品250mg，精密称定，置量瓶中，加乙腈5mL，50℃水浴使完全溶解，放冷，加水定容至刻度，摇匀，离心，上清液过滤，即得供试品溶液。
2.3方法学考察
2.3.1色谱柱及检测波长的选择甲酸属大极性的小分子有机物，在常规的c18色谱柱上较难保留，研究过程中尝试了常规C18色谱柱、HILIC亲水色谱柱和AQ-C18。色谱柱，结果显示，AQ-C18色谱柱对于甲酸有较好的保留且峰形良好，故采用AQ-C18色谱柱进行研究。参考相关文献资料，采用210nm的波长进行考察。
2.3.2线性关系的考察取甲酸对照品适量，精密称定，加20%乙腈溶解并定量稀释成每1mL约含0.1mg的溶液，作为对照品储备液。分别精密量取1、2、3、4、5、6、7mL，置10mL量瓶中，加20%乙腈定容至刻度，作为不同浓度的线性供试液(约相当于甲酸限度浓度的20%～140%)。分别精密量取5μL，按“1.2.1项”色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，以溶液浓度(μg/mL)为横坐标，进行线性回归(过原点)，回归方程为Y=2.88×10-4x，r=0.9957，结果表明，甲酸在10.06～70.39μg/mL浓度范围内，浓度与峰面积的线性良好。
2.3.3精密度试验系统精密度。精密量取甲酸对照品溶液5μL，重复进样6次，甲酸峰面积RSD为1.13%。
重复性试验。平行制备6份替格瑞洛供试品溶液，分别精密量取供试品溶液和甲酸对照品溶液各5μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各样品中的甲酸含量，检验结果显示，6份供试品溶液均未检出甲酸。
2.3.4溶液稳定性试验将样品与甲酸混合，在室温条件下放置，于0、2、4、6、8h取样，以甲酸峰面积计算，RSD值为1.12%，表明样品溶液在室温条件下8h内稳定。
2.3.5准确度试验取甲酸对照品适量，精密称定，加乙腈溶解制成含甲酸为2.5mg/mL的溶液，作为对照品储备液；分别取对照品储备液4、5、6mL，置50mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，制成甲酸浓度分别为0.20、0.25和0.30mg/mL的乙腈溶液，作为标准加入液。另取甲酸对照品适量，精密称定，用20%乙腈制成甲酸浓度约为50μg/mL的溶液，作为对照品溶液。取替格瑞洛样品0.25g，置25mL量瓶中，平行9份，分为三组，分别加入三个浓度的标准加入液5mL，50℃超声使完全溶解，放冷，加水定容至刻度，摇匀，离心，上清液0.45μm滤过，取续滤液作为供试品溶液，分别制成高、中、低3个浓度的供试品溶液，每个浓度下测试3次，计算甲酸的平均回收率(n=9)为98.7%，RSD=0.73%，结果见表2。
2.3.6检测限和定量限取甲酸对照品溶液用流动相逐级稀释，进样分析，按S/N=3(噪音高度的3倍)计算检测限；按S/N=10(噪音高度的10倍)计算定量限。结果甲酸的检测限为1.40μg/mL；定量限为4.66μg/mL。
2.4样品测定
取不同批次的替格瑞洛样品共3批，测定甲酸的含量，结果见表3。
3讨论
甲酸无色而有刺激气味，且有腐蚀性，人类皮肤接触后会起泡红肿，同时具有酸和醛的性质，是基本有机化工原料之一，广泛用于农药、皮革、染料、医药和橡胶等工业。在有机合成中用于合成各种甲酸酯、吖啶类染料和甲酰胺系列医药中间体。甲酸的急性毒性LD50：1100 mg/kg(大鼠经口)；亚急性和慢性毒性：小鼠饮水中含0.01%～0.25%游离甲酸，2～4个月内无任何影响；含0.5%则影响食欲并使其生长缓慢。2015版《中国药典》通则0800限量检查法中附表1药品中常见的残留溶剂及限度中指出，甲酸属于第三类溶剂(药品GMP或其他质量要求限制使用)，规定限度应≤0.5%。为了更好地控制产品质量，需对替格瑞洛原料合成过程中使用倒的甲酸残留进行定量控制。在常规检测中，甲酸含量测定多采用气相色谱法，由于气相方法需要进行衍生化，衍生化程度较难控制，由于甲酸在210nm下具有较强的紫外吸收，且HPLC的灵敏度较高，达到检测要求，故采用操作简易的HPLC法。
在本实验中，通过较全面的方法学验证，建立了一种梯度反相HPLC测定法，并对该方法进行方法学验证，验证结果表明，甲酸在10.06～70.39μg/mL浓度范围内，线性良好；三个浓度平均回收率为98.7%，RSD为0.73%，方法准确度良好；系统精密度、重复性试验结果良好；在室温条件下放置，8h内溶液稳定性良好；检测限为1.40μg/mL，定量限为4.66μg/mL。在该色谱系统中，甲酸色谱峰保留时间适宜，峰形良好，重现性好，灵敏度高可准确可靠地测定替格瑞洛原料药中甲酸残留含量。, http://www.100md.com(黄滔 李合 金鑫)
[关键词]高效液相色谱法；梯度洗脱；替格瑞洛；甲酸
替格瑞洛是首个可逆的结合型P2Y12腺苷二磷酸受体(ADP)拮抗剂，能可逆性地作用于血管平滑肌细胞上的嘌呤2受体亚型P2Y12，对ADP引起的血小板聚集有明显的抑制作用，能有效改善急性冠心病患者的症状，已被证明比Plavix更有效，是第一个证实能减少急性冠脉综合征所有类型的心血管死亡的抗血小板药物。我司的替格瑞洛合成工艺中使用了甲酸溶剂。甲酸为第三类溶剂，根据药典要求，需限制使用，中国药典规定其限度为0.5%。为保证我司替格瑞洛的产品质量，建立了液相分析方法对残留的甲酸含量进行检测，并对该方法进行了方法学验证，确保检测结果的准确可靠。
1仪器与试药
Dionex UltiMate 3000高效液相色谱仪；Chromeleon 7工作站；德国赛多利斯BP211D型电子天平。
替格瑞洛样品(珠海保税区丽珠合成制药有限公司，批号为1403001、1403002、1404001)；甲酸对照品(色谱纯，Fisher)；注射用水；磷酸二氢钠(分析纯，广州化学试剂二厂)；磷酸(分析纯，广州化学试剂厂)。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱为Welch Ultimate AQ-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱温为30℃；流动相A为磷酸缓冲液(50mmol/L的磷酸二氢钠，磷酸调pH值至2.5)；流动相B为乙腈；流速为1.0mL/min；检测波长为210mm；进样量为5μL，按表1采用梯度方式进行洗脱。
2.2溶液制备
取甲酸适量，精密称定，加20%乙腈溶解并定量稀释成每1mL约含50μg甲酸的溶液，加20%乙腈定容至刻度，即得对照品溶液(约50μg/mL)。取本品250mg，精密称定，置量瓶中，加乙腈5mL，50℃水浴使完全溶解，放冷，加水定容至刻度，摇匀，离心，上清液过滤，即得供试品溶液。
2.3方法学考察
2.3.1色谱柱及检测波长的选择甲酸属大极性的小分子有机物，在常规的c18色谱柱上较难保留，研究过程中尝试了常规C18色谱柱、HILIC亲水色谱柱和AQ-C18。色谱柱，结果显示，AQ-C18色谱柱对于甲酸有较好的保留且峰形良好，故采用AQ-C18色谱柱进行研究。参考相关文献资料，采用210nm的波长进行考察。
2.3.2线性关系的考察取甲酸对照品适量，精密称定，加20%乙腈溶解并定量稀释成每1mL约含0.1mg的溶液，作为对照品储备液。分别精密量取1、2、3、4、5、6、7mL，置10mL量瓶中，加20%乙腈定容至刻度，作为不同浓度的线性供试液(约相当于甲酸限度浓度的20%～140%)。分别精密量取5μL，按“1.2.1项”色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，以溶液浓度(μg/mL)为横坐标，进行线性回归(过原点)，回归方程为Y=2.88×10-4x，r=0.9957，结果表明，甲酸在10.06～70.39μg/mL浓度范围内，浓度与峰面积的线性良好。
2.3.3精密度试验系统精密度。精密量取甲酸对照品溶液5μL，重复进样6次，甲酸峰面积RSD为1.13%。
重复性试验。平行制备6份替格瑞洛供试品溶液，分别精密量取供试品溶液和甲酸对照品溶液各5μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各样品中的甲酸含量，检验结果显示，6份供试品溶液均未检出甲酸。
2.3.4溶液稳定性试验将样品与甲酸混合，在室温条件下放置，于0、2、4、6、8h取样，以甲酸峰面积计算，RSD值为1.12%，表明样品溶液在室温条件下8h内稳定。
2.3.5准确度试验取甲酸对照品适量，精密称定，加乙腈溶解制成含甲酸为2.5mg/mL的溶液，作为对照品储备液；分别取对照品储备液4、5、6mL，置50mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，制成甲酸浓度分别为0.20、0.25和0.30mg/mL的乙腈溶液，作为标准加入液。另取甲酸对照品适量，精密称定，用20%乙腈制成甲酸浓度约为50μg/mL的溶液，作为对照品溶液。取替格瑞洛样品0.25g，置25mL量瓶中，平行9份，分为三组，分别加入三个浓度的标准加入液5mL，50℃超声使完全溶解，放冷，加水定容至刻度，摇匀，离心，上清液0.45μm滤过，取续滤液作为供试品溶液，分别制成高、中、低3个浓度的供试品溶液，每个浓度下测试3次，计算甲酸的平均回收率(n=9)为98.7%，RSD=0.73%，结果见表2。
2.3.6检测限和定量限取甲酸对照品溶液用流动相逐级稀释，进样分析，按S/N=3(噪音高度的3倍)计算检测限；按S/N=10(噪音高度的10倍)计算定量限。结果甲酸的检测限为1.40μg/mL；定量限为4.66μg/mL。
2.4样品测定
取不同批次的替格瑞洛样品共3批，测定甲酸的含量，结果见表3。
3讨论
甲酸无色而有刺激气味，且有腐蚀性，人类皮肤接触后会起泡红肿，同时具有酸和醛的性质，是基本有机化工原料之一，广泛用于农药、皮革、染料、医药和橡胶等工业。在有机合成中用于合成各种甲酸酯、吖啶类染料和甲酰胺系列医药中间体。甲酸的急性毒性LD50：1100 mg/kg(大鼠经口)；亚急性和慢性毒性：小鼠饮水中含0.01%～0.25%游离甲酸，2～4个月内无任何影响；含0.5%则影响食欲并使其生长缓慢。2015版《中国药典》通则0800限量检查法中附表1药品中常见的残留溶剂及限度中指出，甲酸属于第三类溶剂(药品GMP或其他质量要求限制使用)，规定限度应≤0.5%。为了更好地控制产品质量，需对替格瑞洛原料合成过程中使用倒的甲酸残留进行定量控制。在常规检测中，甲酸含量测定多采用气相色谱法，由于气相方法需要进行衍生化，衍生化程度较难控制，由于甲酸在210nm下具有较强的紫外吸收，且HPLC的灵敏度较高，达到检测要求，故采用操作简易的HPLC法。
在本实验中，通过较全面的方法学验证，建立了一种梯度反相HPLC测定法，并对该方法进行方法学验证，验证结果表明，甲酸在10.06～70.39μg/mL浓度范围内，线性良好；三个浓度平均回收率为98.7%，RSD为0.73%，方法准确度良好；系统精密度、重复性试验结果良好；在室温条件下放置，8h内溶液稳定性良好；检测限为1.40μg/mL，定量限为4.66μg/mL。在该色谱系统中，甲酸色谱峰保留时间适宜，峰形良好，重现性好，灵敏度高可准确可靠地测定替格瑞洛原料药中甲酸残留含量。, http://www.100md.com(黄滔 李合 金鑫)