生物大数据及人工智能促进肿瘤诊断与治疗创新——访复旦大学附属华山医院消化内科主任刘杰
文图/《中国医药科学》 费菲
生物大数据和人工智能的时代已经到来。人工智能在生物大数据领域的参与度不断提升，促进了医疗健康的进步和发展。相比人脑，人工智能的优越性在于可更高效地处理海量数据，迅速找到一些特征和规律；还可以利用庞大的医学知识库和数据库，建立医生临床辅助决策系统，帮助医生进行疾病诊断和治疗。
在从事消化系统疾病的临床诊疗和研究工作30余年后，复旦大学附属华山医院消化内科主任兼复旦大学消化疾病研究所所长、复旦大学生物医学研究院双聘PI 刘杰教授近几年感受最深的是，他的研究工作已经与生物大数据和人工智能技术密不可分，为临床诊疗带来更多新的策略：基于最新的科研进展建立恶性肿瘤诊疗的系列新方法，包括液体活检肿瘤无创诊断技术，用于肿瘤的诊断和复发监控；通过人工智能技术结合PDX 模型等设计肿瘤精准治疗方案；建立第四代针对实体瘤的分泌型CART 技术，为实体瘤免疫治疗提供手段；开展了基于人工智能的肿瘤个体化新抗原疫苗研究，通过人工智能深度学习算法挖掘新抗原信息，合成特异的新抗原，制成疫苗可注射到对应患者体内，刺激其体内特异的针对新抗原的免疫反应。日前，刘杰教授从生物大数据及人工智能在肿瘤诊疗应用的角度，介绍了相关研究结果。
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制定防治策略应从癌症本质出发
2018 年9 月12 日，Bray F, Ferlay J 等在CA：肿瘤临床医师杂志(CA：Cancer J Clin)发表了一篇最新的全球癌症统计报告，主要分析了2018年各种癌症的发病率和致死率。这项研究通过对185 个国家的研究，着重分析了全球肿瘤发病和致死的地理性差异。研究估计，2018 年全球范围内将有1810 万癌症新发病例和960 万癌症死亡病例。全球范围内发病率和死亡率排名前10 位的癌症数据显示，肺癌是最常见的癌症类型(占所有癌症的11.6%)，也是癌症死亡的主要原因(占癌症总死亡率的18.4%)。女性乳腺癌(11.6%)、结直肠癌(10.2%)、前列腺癌(7.1%)的发病率最高；结直肠癌(9.2%)、胃癌(8.2%)和肝癌(8.2%)死亡率最高。
该杂志在2015 年报道的全球2012 年并结合中国2011 年数据显示，世界每年新发病例数为1400 万，死亡病例数为800 万。2012 年全球癌症统计报告显示，每年癌症新发病例约1400 万，死亡约800 万，女性发病率最高的癌症为乳腺癌，男性最高发的癌症为肺癌。我国每年新发病例337 万例，肺癌、女性乳腺癌、胃癌、结直肠癌、食管癌、宫颈癌、子宫肿瘤、胰腺癌、卵巢癌等约占75%，死亡211 万例；肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、女性乳腺癌、胰腺癌、脑瘤、宫颈癌、白血病等占84%。短短五六年间，癌症的发病率和死亡率都出现了大幅攀升。
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□刘杰：癌症发生的根本原因是免疫失衡
癌症的根源在哪里？刘杰教授介绍，2017 年11月CA：Cancer J Clin杂志报道，77%的癌症根源在于不良生活方式，而遗传因素和环境因素只占到24%和9%。生活方式导致癌症的主要危险因素主要包括以下几个方面：一是吸烟，19.0%的癌症发病和29%的癌症死亡与吸烟有关；二是肥胖，7.8%的癌症发病和6.5%的癌症死亡与肥胖有关；三是饮酒，5.6%的癌症发病和4%的癌症死亡与饮酒有关；四是紫外线辐射，4.7%的癌症发病和1.5%的癌症死亡与紫外线辐射有关；五是缺乏锻炼，2.9%的癌症发病和2.2%的癌症死亡与缺乏锻炼有关；六是缺乏水果蔬菜，1.9%的癌症发病与缺乏水果蔬菜有关；七是缺乏膳食纤维；0.9%的癌症发病与缺乏膳食纤维有关；八是缺钙，0.4%的癌症发病与缺钙有关。
刘杰教授近几年出门诊时经常接诊由不良生活方式导致癌症的20 多岁年轻患者。举两个例子，病例一：21 岁女性患者为胃窦低分化印戒细胞癌伴巨大溃疡，问病史得知其家庭条件优裕，从十几岁开始，大量摄入方便面、各种膨化食品，每天不喝白开水，只喝饮料。病例二：男性，28 岁，某财富公司HR。4 天前出现全身乏力，胃纳减少，易饱腹，无腹痛，排便异常。到院就诊，实验室检查显示，中度贫血，轻度肝酶异常，无黄疸。肿瘤标志物水平：血清中癌胚抗原(CEA)升高(>1000μg/L)，CA199 水平升高(706.3 U/mL)。结肠镜检查提示，横结肠癌伴肠腔狭窄。病理提示，(横结肠)粘液腺癌(判定标准：当CEA 水平>5μg/L，CA199 水平>37 U/mL，CA724 水平>6.9 U/mL 时检测视为阳性)。PET/CT 提示，横结肠局部肠壁明显增厚并FDG 摄取增高(SUVmax=10.5)。根据检查结果考虑为恶性肿瘤伴周围浸润，结肠癌可能大。肝弥漫性转移(SUVmax=6.7)、腹膜广泛种植转移(SUVmax=1.9)、全身多发骨转移(SUVmax=6.7)可能大；腹盆腔积液。初步诊断为横结肠粘液腺癌伴肝、腹壁、骨多发转移。
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在问病史时发现，这名年轻肿瘤患者工作强度高，从早上9 点到晚上9 点，每天工作时间长达12 小时以上，而且多数时间是在与客户通话，工作生活习惯不利于健康。刘杰教授建议，保持健康应该经常到户外活动，多进行日光照射。日光照射比摄入维生素D 加钙对健康更有益。人们长久地坐着使用电脑工作，缺乏阳光照射和维生素D、钙、磷，将对免疫系统造成不良的影响。他总结了可提升免疫力的7 项肿瘤综合防治策略：一是坚持适量运动，多站少坐，每天出点汗；二是保持身心放松，控制坏情绪，每天大笑10次以上；三是保持良好睡眠，必要时用药物促进睡眠；四是少食高热量油炸食物，少食腌制食品；五是常吃水果、豆浆、坚果、灵芝孢子粉、绿茶；六、常补充纤维素，以食物补充为主；七是补充维生素D 和钙，以阳光照射为主。同时指出运动不能过量，如过量也会对机体造成损伤。
他提示说，癌症发生的根本原因是免疫失衡，可以说，癌症是基因突变与免疫的博弈。正常DNA 由于紫外线和各种辐射、化学诱变剂、病毒等因素导致基因突变(肿瘤驱动基因)，免疫监视(DNA 修复，抑癌基因诱导凋亡)，这一过程失败才会导致癌症。每个人身上都有癌细胞，突变细胞是否形成癌，取决于是否处于免疫平衡，它一旦突破这个底线就会膨胀性生长。癌细胞生长非常快，最后患者很快去世是免疫系统崩溃而导致的。还有一个普遍的疑问是，肺结节是否有必要切除，该怎么对肺结节进行观察？刘杰教授认为除了早期切除病变组织的手段，也需要免疫系统与癌细胞的博弈来起作用。70%的肺结节由免疫系统清除癌细胞后避免了癌变，仅20%～30%的肺结节会癌变，所以免疫系统在其中起到相当关键的作用。
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这名年轻患者一经发现就已是癌症晚期，而此前缺乏明显症状，患者家属表示不解。刘杰教授表示，其实这种疑问很有普遍性，如今不少人在国内定期体检，还专门到美国、欧洲、日本等国体检，但常会出现发现癌症时已是晚期的情况。癌症的发展阶段主要分为以下几个阶段：分子癌变阶段(8 ～10 年)、细胞癌变阶段(3 ～5 年)、早癌(1 ～3 年)、中晚期癌。目前癌症检查基本上是靠超声、CT、MRI、PET-CT 等仪器，或是AFP、CEA、PSA 等肿瘤标志物。黄豆大的肿瘤组织里的癌细胞数量都以亿个计，所以一旦影像学发现肿瘤，已经很难说是早期癌症。那么，怎样才能早期发现癌症？刘杰教授团队近年开展的工作之一是基于生物大数据及人工智能的诊断和治疗，同时开展一些其他研究工作，还有一个团队开展基于人工智能大数据开展临床转化相关的工作。近几年他们对癌症的诊断方面主要围绕着基因突变这一领域，治疗以免疫治疗为主，应用几个最新的技术探索出了免疫治疗的一些方法。具体而言，在癌症诊断方面，基于生物大数据及人工智能作出决策主要围绕两个技术：一是疑难病智能诊断平台，二是液体活检早期诊断技术。
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基于大数据的疑难病智能诊断平台
刘杰教授首先介绍了基于大数据的疑难病智能诊断平台的建立及应用。他说，上海复旦大学生命科学学院遗传与发展协同创新中心王毅博士创建的“小王医生”(www.drwang.top)疑难病智能诊断平台，就是一个基于大数据的诊断工具。王毅博士近几年不断研发出一些新的技术，其中“小王医生”可帮助医生进行疾病辅助诊断，而“小易医生”则针对老百姓问诊。
在“小易医生”上，患者可以问诊并获得诊断，得到很有用的信息提示，比如，对应症状的是什么疾病，头痛、发烧、咳嗽的诊断治疗可全部列出。如果能提供全基因组数据，诊断率基本能达到95% ～ 100%，对疑难杂症的诊断也很有参考价值。
“小王医生”(www.drwang.top)是一个精准医学支持系统，通过测评后发现，“小王医生”在人类疾病的基因诊断方向上达到全球领先水平。它基于1200 万篇PubMed 文献摘要和文本挖掘算法，可以提供对疾病的辅助诊断。两分钟内可以提取60 万的文献量，相当于医生在会诊疑难病时，旁边有个智能大脑，将症状一输入(如果结合二代基因组数据诊断更精准)，就能寻找疾病相关的表型，根据临床表型列出10 项可能疾病的列表，包括寻找疾病相关的基因和遗传突变，寻找疾病相关的药物，以及寻找疾病相关的专家名单等信息。
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临床上常会遇到不明原因的肿瘤找不到原发灶的困惑。比如，刘杰教授接诊的一名北京患者全身查体，包括CT、胃肠镜等都查不到原发灶；还有杭州患者腹股沟两串淋巴结转移，却找不着原发灶。通过疑难病智能诊断平台这项技术可以为诊断提供方向。目前利用“小王医生”和全基因组测序技术已经辅助诊断了30 例罕见病，找到了遗传突变。
以一名患者的诊断为例：深圳男性患儿，10 岁。在北京体检时发现肝纤维化伴有轻度脂肪肝，后经华山医院肝脏病理证实。无肝病病史，父母健康。肝功化验等检查无明显异常。先天性肝纤维化(CHF)伴有多囊肝及多囊肾的PKHD1，考虑为突变的Caroli病(先天性肝内胆管扩张症)。把孩子的症状等代入这个系统，提示他是患上了希特林缺乏症(Citrin Deficiency)。那么，什么是希特林缺乏症？Citrin 是线粒体内钙结合天冬氨酸/谷氨酸载体蛋白，编码基因为SLC25A13。患儿对糖代谢存在障碍，不能吃米饭馒头，他父母不了解这个情况，给他吃了这些食物，孩子肝脏不能代谢导致肝纤维化。
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液体活检技术应用于肿瘤早期筛查
近年来，液体活检早期诊断技术在全球引发较大关注，国际上最顶尖的学术期刊《自然》(Nature)、《科学》(Science)、新英格兰医学杂志(NEJM)、《美国国家科学院院刊》(PANS)相继发表相关论文，《麻省理工大学科技评论》将该技术评选为“2015 年十大突破技术”，并入选美国临床肿瘤学会(ASCO) 2015 年肿瘤年度进展报告10 年前瞻。
这项基于表观遗传学的液体活检新技术研究的主要原理是，利用高效的全基因组5hmC(5-羟甲基胞嘧啶)检测方法，检测胃肠癌及癌旁组织、胃肠癌及健康个体血浆。通过分析血浆cfDNA 中全基因组肿瘤特异性5hmC，将之作为肿瘤早期特异性诊断指标，以此反映疾病的状态，较传统的ctDNA 检测具有更高的特异性与敏感性。通过诊断可分别得出胃肠良性病、胃肠癌、非胃肠肿瘤与健康个体的结论。“中间体”5hmC 不仅标志着主动去甲基化，也是一个具有表观遗传作用的相对稳定的DNA 标记。基于循环游离cfDNA 5mC 和5hmC 的液体活检可能更有价值，因为其能影响基因表达的变化。
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基于表观遗传学在肿瘤早期筛查方面的特性，5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)高通量检测技术的发明，为解决这一问题带来了新的可能。目前，5hmC 已被认为是极具前景的表观遗传学肿瘤标志物。《自然综述-遗传学》(Nature Reviews Genetics )杂志2011 年报道，5hmC 是基因转录激活的特征之一。在DNA 主动去甲基化过程中，5hmC 作为一个中间体，是由TET 酶介导的5mC 的氧化产物蛋白。5hmC 主要在全能性基因的外显子内部和靠近转录起始点附近富集，且该位点常伴有H3K4me3，因此5hmC 可看作转录激活的特征之一。《癌细胞》(Cancer Cell)、Trends Genet、Epigenomics 等杂志的多篇文献报道，5hmC 表达水平与肿瘤具有相关性。羟甲基化与包括癌症在内的多种疾病有关，且羟甲基化被报道在肿瘤组织中低表达。
2011 年《自然-生物技术》杂志(Nature biotechnol)报道了5hmC 检测技术——hmC-Seal。2016 年《细胞》杂志子刊《分子细胞》(Molecular Cell)报道了低输入量DNA 的5hmC 测序技术——Nano-hmC-Seal。优化技术Nano-hmC-Seal 可稳定重现不同DNA 输入量的结果，可适用DNA 总量范围：1ng ～100μg，在不同样本类型中均可实现检测的可能，满足液体活检低量cfDNA的检测要求。
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人肿瘤血中存在循环游离cfDNA 5hmC 生物标志物，不同来源的肿瘤(如肺、结肠、胃、肝、卵巢、胰腺)会释放不同的5hmC 修饰的cfDNA,而cfDNA 5hmC的检测技术能实现低至1ng DNA 的检测。低输入量DNA 的5hmC 测 序 技 术——Nano-hmC-Seal，只 需1ng DNA 即可进行表观测序，说明这一测序方法十分敏感，具有临床推广价值。刘杰团队随后用小鼠模型进行验证也获得了成功，当时提取的小鼠血量很少，却能够支持液体活检技术(表观测序技术)，这就为临床推广这项技术带来了很大的便利。这是因为，如果医生要求患者进行表观测序需要抽20 毫升血，患者必会有所抗拒，而只需抽1mL 血就能进行表观测序，患者应该愿意配合。
研究共纳入90 例健康人群，260 例肿瘤患者(包括80 例结直肠癌、71 例胃癌、25 例肝癌、34 例胰腺癌、46 例甲状腺癌等)，71 例胃肠良性病患者。研究者对5hmC 修饰在血浆cfDNA 和组织全基因组DNA 中均进行了检测。由于cfDNA 不单单是肿瘤释放的，更多是由免疫系统释放的，因此，研究监测目标是机体的整体免疫状况，同时对肝癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤均制定了诊断标准。
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刘杰教授发现，差异性的5hmC 位点是与肿瘤来源显著相关的。循环游离cfDNA 5hmC 表达谱与肿瘤组织及血细胞中全基因组DNA 5hmC 表达谱不全相同，其与DNA 不同的组织细胞来源有很大关系。差异性5hmC 在cfDNA 上的分布广泛且特异。肿瘤中基因表达的差异与5hmC 水平的差异密切相关，这就提示5hmC 对基因具有调控功能。他的研究团队进一步开展来源的相似性度量分析后发现，健康人与肠癌患者游离cfDNA 的差异性5hmC 分布在组蛋白修饰区与基因体区。以癌基因SULF1(sulfatase1) Gene 为例，健康人群和结肠癌患者血浆中存在明显差异5hmC 位点。
循环游离cfDNA 5hmC 可作为肠癌的有效诊断标志物(从discovery batch 中检测出989 个差异性5hmC位点)。来源于血浆中的游离cfDNA 5hmC 能够明显区分结直肠癌症患者和健康人群。在discovery batch 和validation batch 两组中，cfDNA 基因体的5hmC 改变具有更大的相关性，提示基因体的5hmC 位点可作为更稳定的肿瘤标志物。研究结果显示，结直肠癌、胃癌诊断率达到90%以上，于是他们进一步扩大样本进行验证。其后的初步研究结果显示，差异性cfDNA 5hmC 在结直肠癌诊断中的灵敏度、特异度可达80%～90%，能够实现结直肠癌的早期诊断；具有组织特异性，在胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌的预测概率均下降。
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循环游离cfDNA 5hmC 也可作为胃癌的有效诊断标志物(从discovery batch 中检测出1431 个差异性5hmC位点)。来源于血浆中的游离cfDNA 5hmC 能明显区分胃癌患者和健康人群。其后的初步研究结果也显示，差异性cfDNA 5hmC 在胃癌诊断中的灵敏度、特异度可达90%，能实现胃癌的早期诊断；具有组织特异性，在结直肠癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌的预测概率均下降。
为了验证肿瘤患者血浆中cfDNA 的5hmC 肿瘤相关性，刘杰团队利用PDX 模型验证其来源。利用5hmC 技术捕获PDX 模型血浆中人源的cfDNA 序列，胃癌、肠癌PDX 血浆中人源的cfDNA 序列比例明显比对照小鼠多。PDX 血浆中cfDNA 与供体肿瘤基因组DNA 二者的5hmC 表达谱之间的相关性与PDX 模型传代次数相关，传代次数越多，移植瘤越稳定。PDX模型中的血浆cfDNA 5hmC 与供体肿瘤DNA 5hmC 来源一致，患者血浆cfDNA 5hmC 表达水平与PDX 模型cfDNA 表达水平一致。
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在未来，临床医生有望通过液体活检对疾病进行诊断和治疗，ctDNA 液体活检将替代侵入组织活检(比如肝穿刺、肾穿刺、肺穿刺)，成为肿瘤诊断领域突破性的新技术。同时，液体活检对治疗也有帮助，比如肺癌EGFA 检测就可以给药，还可以进行靶向药治疗；但从另一方面来说，液体活检对诊断的价值还需要进一步提高，因为肿瘤不是单基因疾病，而是多基因疾病。
由于缺乏用于早期诊断的灵敏特异的生物标志物，临床上常会出现肝癌患者在癌症早期无明显症状，甚至患病后较长时间毫无知觉，从而导致常常错过最佳治疗期，一般就诊时已到中晚期，甚至已向肺部等处转移，临床预后差。目前运用传统检测方法，如甲胎蛋白(AFP)，在肝癌早期诊断中的价值十分有限，有40%的早期肝癌患者无法被检测出，成为影响我国肝癌死亡率的重要因素。因此，寻找新型的、高效的肝癌早期筛查方式显得尤为重要。
目前全球主流的DNA 测序都是分析特定DNA片段的碱基序列ATCG，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤的(G)排列方式。刘杰教授团队则进行了DNA 链上的开关功能测序，称为DNA 胞嘧啶(cytosine)表观遗传修饰。他认为，人体衰老及很多疾病尤其是免疫疾病的发生与基因开关有关，即病根在于调控开关不能打开，因此表观基因测序5hmC(5-羟甲基胞嘧啶)的测序技术非常关键。
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“如果临床医生把自己研究领域与新的技术进行交叉，对临床诊疗能带来很大的提高。”刘杰教授说。多年来他始终注重开展学科交叉研究，由此在国内较早开展了全基因组5hmC 测序。他曾与一位知名化学家合作开展学科交叉研究，共同开展973 课题，还积极开展了与物理学、材料学、人工智能的学科交叉研究。
6 年前，刘杰教授就与芝加哥大学开发DNA 修饰碱基5hmC 的检测和测序的化学家何川教授合作，研究如何进行5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)高通量检测技术技术转化。他们当时设计的项目是基于大数据的诊断结合人工智能技术。通过在临床收集近4000 例样本，经机器学习和大数据分析，利用肝癌样品和健康良性样品的差异基因建立5hmC 肝癌诊断模型。近期得出的研究结论是：5hmC 高通量检测技术最大的优势在于它能够实时监控癌症的状态，及时反映受检者是否罹患癌症，是一个真正具有实际意义的癌症早筛技术，可大幅提高肝细胞癌症检测的准确率(灵敏度达90%、特异性可达94%)，相信应用于临床不仅能提高肝癌的早期诊断率，还能及时监测肝癌的复发和转移。
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刘杰教授指出，在肿瘤治疗中，现在人们都盯着肿瘤这个“小偷”去开展研究，但小偷是各种各样经常变化的(肿瘤突变异质性和突变动态演化)，而且老盯着肿瘤去治疗，比如化疗，而忽视了对免疫系统的重要性是得不偿失的。就像靶向治疗，今天靶向治疗了一个小偷，明天后天又出来其他的小偷，是抓不完的，所以不如把自身免疫防线建设得很强大。他们目前的研究工作集中在肿瘤诊断研究方面，怎么从患者的免疫系统的状况来判定，免疫系统状况到哪一步患者可能要发生肿瘤了。刘杰教授同时提示，应重视生活习惯对免疫系统的影响，他最近接诊的3 名肿瘤患者都是62 岁，刚退休不久，这可能是人们改变生活习惯时会给免疫系统带来非常大的影响。目前该项技术在芝加哥大学、北京大学合成与功能生物分子中心、华山医院复旦大学消化疾病研究所、复旦大学附属中山医院、原第二军医大学第三附属医院东方肝胆外科医院等多家医院、研究机构正在进行多项研究合作。
人工智能精准治疗方案给肿瘤“个体化打击”
, 百拇医药 在肿瘤治疗方面，刘杰教授主要从他们团队三个方面的工作进行了介绍。一是精准方案选择——协同抗癌药物组合的高效筛选系统(RACS)；二是肿瘤免疫治疗(第四代分泌型CAR-T)；三是肿瘤新抗原疫苗(Neoantigen)。
第一，如何选择癌症精准治疗方案？可应用协同抗癌药物组合的高效筛选系统(RACS)。
刘杰教授团队和同济大学生命科学与技术学院曹志伟教授合作开发基于药靶网络和组学数据的协同抗癌药物组合的高效筛选系统(RACS)。这套人源性肿瘤移植动物模型(PDX)建立及方案筛选，将国际上的协同用药预测准确率从 61%提升到了78% (随机预测为 50%)。协同用药预测排序与标准排序的吻合度达0.78，该研究已申请了专利。
胃癌、肠癌、肝癌等各种癌症有差异，不同的肝癌患者也有差异，刘杰团队为每个患者个性化建成一个调控网络，根据调控网络，设计一个非常精准合理的给药方案，包括以哪些药物是阻断药，哪些药物起协同作用，这些药物怎么去阻断肿瘤又不影响免疫系统。任何药物理论上都可以筛选，比如针对胃癌可以筛选100 种药物。 通过研究现有的抗癌药物组合的靶点和癌症基因表达谱特征，采用机器学习算法，提取出具有协同作用的抗癌药物组合的网络靶向特征，并将其用于潜在协同药物组合的排序筛选。RACS 系统先后在B-细胞淋巴癌、乳腺癌和肺癌细胞系上分别进行了实验验证，并利用斑马鱼肿瘤模型，验证出一组具有强协同作用且低毒的抗乳腺癌协同药物组合。
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刘杰教授表示，RACS 是一个大规模的人工智能筛选系统，各种癌症都可以通过RACS 系统上筛选出上市药物。当输入患者的资料 ，就能提供一个用药指导方案，临床验证效果非常好，他们团队正在进一步完善这一系统。
第二，肿瘤免疫治疗——第四代分泌型CAR-T。
肿瘤治疗领域突破性进展主要体现在免疫治疗领域，肿瘤免疫治疗被《科学》(Science)评为2013 年“年度突破”之首。这种观点认为，机体免疫系统是抗肿瘤的前沿与核心，是当下肿瘤治疗领域最具前景的发展方向之一。
2018 年，免疫检查点抑制剂(PD-1/PDL1 抗体)摘得诺贝尔生理学或医学奖的桂冠，而免疫治疗的另一支主力——CAR-T 也迎来了多次重要发现与突破。CAR-T 抗击肿瘤的原理是给患者自身的免疫细胞T细胞加入一段外源基因，通过基因改造使其表面表达CAR 受体，CAR 受体上可以装上针对不同配体的“雷达”，从而使患者自身的免疫细胞能够识别不同的肿瘤，并将其消灭。其原理是经嵌合抗原受体修饰的T细胞能特异性识别靶抗原，并能脱离主要组织相容性复合体的限制，单独执行杀伤靶细胞的功能。
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《新英格兰医学杂志》(NEJM)在2013 年以及Annual review 杂志在2014 年报道，针对CD19 抗原的CAR-T 细胞对急性淋巴细胞白血病的完全缓解率超过90%。实际上，目前CAR-T 免疫治疗大多都是针对血液系统肿瘤，那么对实体瘤怎么治疗呢？肿瘤细胞可通过PD-1 等免疫检查点抑制T 细胞杀伤功能；阻断该分子就能激活T 细胞。已有靶向PD-1 和CTLA-4的四种抗体药物获批上市，治疗非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤等。目前全球登记临床试验已达到237 项(Clinicaltrials.gov)。比 如，KEYNOTE-001 研 究 针 对PD-1 单抗，治疗非小细胞肺癌495 例，PD-L1 <50%，ORR 19.4%，PFS 3.7 个 月。NCT01295827 研 究 针 对PD-1 单抗，治疗晚期恶性黑色素瘤173 例，ORR 26%。
嵌合抗原受体修饰的T 细胞(CAR-T)根据不同的胞内信号转导结构域可分为：第一代CAR-T：仅包含CD3-zeta；第二代CAR-T：包括CD3-zeta 和一种共刺激分子结构域；第三代CAR-T：包含CD3-zeta和两种共刺激分子结构域，因为T 细胞活化需要两个信号。综合2010 至2014 年Molecular therapy 杂志等文献发现，CAR-T 治疗实体瘤效果不佳的原因主要有：一是生物屏障，经静脉回输的CAR-T 细胞要发挥治疗作用，必须通过血液循环系统，趋向到肿瘤部位，只有少量CAR-T 细胞能最终靶向肿瘤部位并接触到抗原丰富的肿瘤组织；二是免疫抑制微环境，调节性T细胞(Treg)等细胞及其分泌的细胞因子，如IL-10 可以通过直接或间接的方式抑制T 细胞的功能。基因修饰途径以逆转录病毒介导易造成基因组突变，持续表达易造成严重副作用。
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在过去的几年里，CAR-T 细胞疗法与双特异性抗体疗法使T 细胞能有效地靶向CD19 等抗原，使罹患B 细胞恶性癌症的患者得到了极好的缓解，也为肿瘤免疫疗法领域带来了革新。2011 年至2013 年Expert Opin Biol Ther 等杂志发表的文献显示，双特异性T 细胞连接子(BiTEs)，利用单链双特异性抗体技术将同一或不同细胞上两种单克隆抗体(抗原表位)连接起来。局限性为半衰期短，内源的效应T 细胞不足以及严重副作用。
第四代实体瘤CART 的研制由刘杰教授团队和储以微教授团队开展。体内实验：裸鼠皮下荷瘤胃癌细胞，第8、14、20 天静脉注射HER2-CART 细胞，HER2-CART 显著抑制肿瘤生长，延长裸鼠生存期。第四代GPC3-CAR 结构以CD3 抗体代替传统CAR的胞内段，并mRNA 电转T 细胞表达。目前研究已完成并发表了相关论文。
第三，“肿瘤新抗原”疫苗比CAR-T 治疗更安全。
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刘杰教授团队开展的另一项工作是国家基金委的重点项目——新抗原疫苗的研制工作。研发流程主要包括以下四个方面。一是新抗原人工智能预测。基于人工智能与表位肽预测融合排序，构建肿瘤个体化抗原肽组合疫苗。二是新抗原免疫功能评估。体内外实验确定新抗原肽的免疫原性以及特异性。三是新抗原疫苗临床试验。设计新抗原肽组合疫苗Ⅰ期临床试验，验证其安全性和有效性。四是新抗原肽组合疫苗注射前后T 细胞发生变化的机制研究。目前该项研究的结果已经发布。
2017 年7 月13 日《自然》(Nature)杂志同一天发布两项基于新抗原的个体化肿瘤疫苗研究，文章结论是肿瘤新抗原临床应用安全、可行且疗效明显。《自然》(Nature，2017 年7 月)报道6 例晚期恶性黑色素瘤接受Neoantigen 对应的抗原肽制备的疫苗治疗，其中4 例注射后25 个月维持无复发，2 例注射后出现复发者接受PD-1 抗体治疗后完全缓解。Nature 杂志(2017 年)报道13 例晚期黑色素瘤注射neoantigen 对应RNA 制备的个体化疫苗后，无复发生存期明显延长。
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肿瘤新抗原(neoantigen)是由肿瘤细胞基因变异产生，是一种位于肿瘤细胞表面主要组织相容性复合物的抗原表位肽(8～12 肽)，不存在于正常组织。具有强免疫原性，使免疫学会识别其为“非我”抗原。新抗原(neoantigen)可为提升肿瘤疫苗的疗效提供帮助。那么，新抗原人工智能预测又是什么？它是基于人工智能与表位肽预测融合排序系统构建肿瘤个体化抗原肽组合。肿瘤特异性突变筛选，原代肿瘤细胞寻找非同义突变，外周血单个核细胞PBMC 进行HLA Ⅰ、Ⅱ分型，人工智能SEPPA，抗原表位与HLA 亲和力预测。CE-BLAST 抗原表位识别TCR 相似度预测，再通过融合排序系统的突变嵌合亲和力差异、基因表达水平、TCR 结合概率、肿瘤突变负荷、基因功能评估、阴性过滤等计算规则，获得潜在新抗原肽组合。
为什么现在能研制肿瘤新抗原疫苗而以前不能？刘杰教授认为，这是因为人工智能和大数据出现之前，很多抗原都是正常细胞有而肿瘤表达高的相关抗原；而借助人工智能和大数据后，就能找到健康细胞没有而肿瘤细胞有的抗原表位肽(8～12 肽)，找到后进行大量的排序和人工智能评估，观察是否有体外激活功能，再通过制备疫苗进行机体免疫治疗，在切除肿瘤后立刻进行治疗预防双管齐下，注射特异性的新抗原疫苗。通过这项免疫技术治疗非常安全，效果较为理想，而CAR-T 治疗尚无法避免细胞因子风暴的产生。
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专家小传
刘杰教授，复旦大学附属华山医院消化科主任、博士生导师、教授、主任医师。擅长癌前病变的早期预警及干预、消化肿瘤的综合诊治及康复，消化系统疑难杂症。国家“长江学者”奖励计划特聘教授；国家“杰出青年基金”获得者；国家人事部新世纪百千万人才工程“国家级人选”；国家教育部“新世纪优秀人才”资助计划获得者；上海市“优秀学科带头人”及上海市“领军人才”。复旦大学消化疾病研究所所长，复旦大学生物医学研究院双聘教授。留学美国Thomas Jefferson 大学6 年。主要从事临床疑难病例研究及消化肿瘤的综合诊治，包括肿瘤的早期预警，肿瘤高危患者筛选及干预，肿瘤患者的个体化精准综合治疗及康复方案选择。克隆出国际上未见报道的肝硬化癌变早期预警新基因，具有重要的癌变预警价值；率先建立核酸适配体筛选平台并鉴定出抗胃癌、肝癌和乙肝特异性核酸适配体，填补本领域国内空白，提供了肿瘤早诊及抗乙肝新药创制全新策略；临床研究中积极走转化医学之路，在Nature 子刊发表的临床病例研究被美国医师协会推举为继续医学教育教材。利用模糊数学理论建立了胃癌前病变癌变概率的判别模式，对高危癌前病变的判定具有重要价值。先后获得世界胃肠病学大会“青年医师奖”、省级“十大杰出青年” 、赛克勒中国医师“年度奖”、上海市“优秀学科带头人” 、教育部“长江学者”特聘教授等荣誉。, 百拇医药(文图 中国医药科学 费菲)
生物大数据和人工智能的时代已经到来。人工智能在生物大数据领域的参与度不断提升，促进了医疗健康的进步和发展。相比人脑，人工智能的优越性在于可更高效地处理海量数据，迅速找到一些特征和规律；还可以利用庞大的医学知识库和数据库，建立医生临床辅助决策系统，帮助医生进行疾病诊断和治疗。
在从事消化系统疾病的临床诊疗和研究工作30余年后，复旦大学附属华山医院消化内科主任兼复旦大学消化疾病研究所所长、复旦大学生物医学研究院双聘PI 刘杰教授近几年感受最深的是，他的研究工作已经与生物大数据和人工智能技术密不可分，为临床诊疗带来更多新的策略：基于最新的科研进展建立恶性肿瘤诊疗的系列新方法，包括液体活检肿瘤无创诊断技术，用于肿瘤的诊断和复发监控；通过人工智能技术结合PDX 模型等设计肿瘤精准治疗方案；建立第四代针对实体瘤的分泌型CART 技术，为实体瘤免疫治疗提供手段；开展了基于人工智能的肿瘤个体化新抗原疫苗研究，通过人工智能深度学习算法挖掘新抗原信息，合成特异的新抗原，制成疫苗可注射到对应患者体内，刺激其体内特异的针对新抗原的免疫反应。日前，刘杰教授从生物大数据及人工智能在肿瘤诊疗应用的角度，介绍了相关研究结果。
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制定防治策略应从癌症本质出发
2018 年9 月12 日，Bray F, Ferlay J 等在CA：肿瘤临床医师杂志(CA：Cancer J Clin)发表了一篇最新的全球癌症统计报告，主要分析了2018年各种癌症的发病率和致死率。这项研究通过对185 个国家的研究，着重分析了全球肿瘤发病和致死的地理性差异。研究估计，2018 年全球范围内将有1810 万癌症新发病例和960 万癌症死亡病例。全球范围内发病率和死亡率排名前10 位的癌症数据显示，肺癌是最常见的癌症类型(占所有癌症的11.6%)，也是癌症死亡的主要原因(占癌症总死亡率的18.4%)。女性乳腺癌(11.6%)、结直肠癌(10.2%)、前列腺癌(7.1%)的发病率最高；结直肠癌(9.2%)、胃癌(8.2%)和肝癌(8.2%)死亡率最高。
该杂志在2015 年报道的全球2012 年并结合中国2011 年数据显示，世界每年新发病例数为1400 万，死亡病例数为800 万。2012 年全球癌症统计报告显示，每年癌症新发病例约1400 万，死亡约800 万，女性发病率最高的癌症为乳腺癌，男性最高发的癌症为肺癌。我国每年新发病例337 万例，肺癌、女性乳腺癌、胃癌、结直肠癌、食管癌、宫颈癌、子宫肿瘤、胰腺癌、卵巢癌等约占75%，死亡211 万例；肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、女性乳腺癌、胰腺癌、脑瘤、宫颈癌、白血病等占84%。短短五六年间，癌症的发病率和死亡率都出现了大幅攀升。
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□刘杰：癌症发生的根本原因是免疫失衡
癌症的根源在哪里？刘杰教授介绍，2017 年11月CA：Cancer J Clin杂志报道，77%的癌症根源在于不良生活方式，而遗传因素和环境因素只占到24%和9%。生活方式导致癌症的主要危险因素主要包括以下几个方面：一是吸烟，19.0%的癌症发病和29%的癌症死亡与吸烟有关；二是肥胖，7.8%的癌症发病和6.5%的癌症死亡与肥胖有关；三是饮酒，5.6%的癌症发病和4%的癌症死亡与饮酒有关；四是紫外线辐射，4.7%的癌症发病和1.5%的癌症死亡与紫外线辐射有关；五是缺乏锻炼，2.9%的癌症发病和2.2%的癌症死亡与缺乏锻炼有关；六是缺乏水果蔬菜，1.9%的癌症发病与缺乏水果蔬菜有关；七是缺乏膳食纤维；0.9%的癌症发病与缺乏膳食纤维有关；八是缺钙，0.4%的癌症发病与缺钙有关。
刘杰教授近几年出门诊时经常接诊由不良生活方式导致癌症的20 多岁年轻患者。举两个例子，病例一：21 岁女性患者为胃窦低分化印戒细胞癌伴巨大溃疡，问病史得知其家庭条件优裕，从十几岁开始，大量摄入方便面、各种膨化食品，每天不喝白开水，只喝饮料。病例二：男性，28 岁，某财富公司HR。4 天前出现全身乏力，胃纳减少，易饱腹，无腹痛，排便异常。到院就诊，实验室检查显示，中度贫血，轻度肝酶异常，无黄疸。肿瘤标志物水平：血清中癌胚抗原(CEA)升高(>1000μg/L)，CA199 水平升高(706.3 U/mL)。结肠镜检查提示，横结肠癌伴肠腔狭窄。病理提示，(横结肠)粘液腺癌(判定标准：当CEA 水平>5μg/L，CA199 水平>37 U/mL，CA724 水平>6.9 U/mL 时检测视为阳性)。PET/CT 提示，横结肠局部肠壁明显增厚并FDG 摄取增高(SUVmax=10.5)。根据检查结果考虑为恶性肿瘤伴周围浸润，结肠癌可能大。肝弥漫性转移(SUVmax=6.7)、腹膜广泛种植转移(SUVmax=1.9)、全身多发骨转移(SUVmax=6.7)可能大；腹盆腔积液。初步诊断为横结肠粘液腺癌伴肝、腹壁、骨多发转移。
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在问病史时发现，这名年轻肿瘤患者工作强度高，从早上9 点到晚上9 点，每天工作时间长达12 小时以上，而且多数时间是在与客户通话，工作生活习惯不利于健康。刘杰教授建议，保持健康应该经常到户外活动，多进行日光照射。日光照射比摄入维生素D 加钙对健康更有益。人们长久地坐着使用电脑工作，缺乏阳光照射和维生素D、钙、磷，将对免疫系统造成不良的影响。他总结了可提升免疫力的7 项肿瘤综合防治策略：一是坚持适量运动，多站少坐，每天出点汗；二是保持身心放松，控制坏情绪，每天大笑10次以上；三是保持良好睡眠，必要时用药物促进睡眠；四是少食高热量油炸食物，少食腌制食品；五是常吃水果、豆浆、坚果、灵芝孢子粉、绿茶；六、常补充纤维素，以食物补充为主；七是补充维生素D 和钙，以阳光照射为主。同时指出运动不能过量，如过量也会对机体造成损伤。
他提示说，癌症发生的根本原因是免疫失衡，可以说，癌症是基因突变与免疫的博弈。正常DNA 由于紫外线和各种辐射、化学诱变剂、病毒等因素导致基因突变(肿瘤驱动基因)，免疫监视(DNA 修复，抑癌基因诱导凋亡)，这一过程失败才会导致癌症。每个人身上都有癌细胞，突变细胞是否形成癌，取决于是否处于免疫平衡，它一旦突破这个底线就会膨胀性生长。癌细胞生长非常快，最后患者很快去世是免疫系统崩溃而导致的。还有一个普遍的疑问是，肺结节是否有必要切除，该怎么对肺结节进行观察？刘杰教授认为除了早期切除病变组织的手段，也需要免疫系统与癌细胞的博弈来起作用。70%的肺结节由免疫系统清除癌细胞后避免了癌变，仅20%～30%的肺结节会癌变，所以免疫系统在其中起到相当关键的作用。
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这名年轻患者一经发现就已是癌症晚期，而此前缺乏明显症状，患者家属表示不解。刘杰教授表示，其实这种疑问很有普遍性，如今不少人在国内定期体检，还专门到美国、欧洲、日本等国体检，但常会出现发现癌症时已是晚期的情况。癌症的发展阶段主要分为以下几个阶段：分子癌变阶段(8 ～10 年)、细胞癌变阶段(3 ～5 年)、早癌(1 ～3 年)、中晚期癌。目前癌症检查基本上是靠超声、CT、MRI、PET-CT 等仪器，或是AFP、CEA、PSA 等肿瘤标志物。黄豆大的肿瘤组织里的癌细胞数量都以亿个计，所以一旦影像学发现肿瘤，已经很难说是早期癌症。那么，怎样才能早期发现癌症？刘杰教授团队近年开展的工作之一是基于生物大数据及人工智能的诊断和治疗，同时开展一些其他研究工作，还有一个团队开展基于人工智能大数据开展临床转化相关的工作。近几年他们对癌症的诊断方面主要围绕着基因突变这一领域，治疗以免疫治疗为主，应用几个最新的技术探索出了免疫治疗的一些方法。具体而言，在癌症诊断方面，基于生物大数据及人工智能作出决策主要围绕两个技术：一是疑难病智能诊断平台，二是液体活检早期诊断技术。
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基于大数据的疑难病智能诊断平台
刘杰教授首先介绍了基于大数据的疑难病智能诊断平台的建立及应用。他说，上海复旦大学生命科学学院遗传与发展协同创新中心王毅博士创建的“小王医生”(www.drwang.top)疑难病智能诊断平台，就是一个基于大数据的诊断工具。王毅博士近几年不断研发出一些新的技术，其中“小王医生”可帮助医生进行疾病辅助诊断，而“小易医生”则针对老百姓问诊。
在“小易医生”上，患者可以问诊并获得诊断，得到很有用的信息提示，比如，对应症状的是什么疾病，头痛、发烧、咳嗽的诊断治疗可全部列出。如果能提供全基因组数据，诊断率基本能达到95% ～ 100%，对疑难杂症的诊断也很有参考价值。
“小王医生”(www.drwang.top)是一个精准医学支持系统，通过测评后发现，“小王医生”在人类疾病的基因诊断方向上达到全球领先水平。它基于1200 万篇PubMed 文献摘要和文本挖掘算法，可以提供对疾病的辅助诊断。两分钟内可以提取60 万的文献量，相当于医生在会诊疑难病时，旁边有个智能大脑，将症状一输入(如果结合二代基因组数据诊断更精准)，就能寻找疾病相关的表型，根据临床表型列出10 项可能疾病的列表，包括寻找疾病相关的基因和遗传突变，寻找疾病相关的药物，以及寻找疾病相关的专家名单等信息。
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临床上常会遇到不明原因的肿瘤找不到原发灶的困惑。比如，刘杰教授接诊的一名北京患者全身查体，包括CT、胃肠镜等都查不到原发灶；还有杭州患者腹股沟两串淋巴结转移，却找不着原发灶。通过疑难病智能诊断平台这项技术可以为诊断提供方向。目前利用“小王医生”和全基因组测序技术已经辅助诊断了30 例罕见病，找到了遗传突变。
以一名患者的诊断为例：深圳男性患儿，10 岁。在北京体检时发现肝纤维化伴有轻度脂肪肝，后经华山医院肝脏病理证实。无肝病病史，父母健康。肝功化验等检查无明显异常。先天性肝纤维化(CHF)伴有多囊肝及多囊肾的PKHD1，考虑为突变的Caroli病(先天性肝内胆管扩张症)。把孩子的症状等代入这个系统，提示他是患上了希特林缺乏症(Citrin Deficiency)。那么，什么是希特林缺乏症？Citrin 是线粒体内钙结合天冬氨酸/谷氨酸载体蛋白，编码基因为SLC25A13。患儿对糖代谢存在障碍，不能吃米饭馒头，他父母不了解这个情况，给他吃了这些食物，孩子肝脏不能代谢导致肝纤维化。
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液体活检技术应用于肿瘤早期筛查
近年来，液体活检早期诊断技术在全球引发较大关注，国际上最顶尖的学术期刊《自然》(Nature)、《科学》(Science)、新英格兰医学杂志(NEJM)、《美国国家科学院院刊》(PANS)相继发表相关论文，《麻省理工大学科技评论》将该技术评选为“2015 年十大突破技术”，并入选美国临床肿瘤学会(ASCO) 2015 年肿瘤年度进展报告10 年前瞻。
这项基于表观遗传学的液体活检新技术研究的主要原理是，利用高效的全基因组5hmC(5-羟甲基胞嘧啶)检测方法，检测胃肠癌及癌旁组织、胃肠癌及健康个体血浆。通过分析血浆cfDNA 中全基因组肿瘤特异性5hmC，将之作为肿瘤早期特异性诊断指标，以此反映疾病的状态，较传统的ctDNA 检测具有更高的特异性与敏感性。通过诊断可分别得出胃肠良性病、胃肠癌、非胃肠肿瘤与健康个体的结论。“中间体”5hmC 不仅标志着主动去甲基化，也是一个具有表观遗传作用的相对稳定的DNA 标记。基于循环游离cfDNA 5mC 和5hmC 的液体活检可能更有价值，因为其能影响基因表达的变化。
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基于表观遗传学在肿瘤早期筛查方面的特性，5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)高通量检测技术的发明，为解决这一问题带来了新的可能。目前，5hmC 已被认为是极具前景的表观遗传学肿瘤标志物。《自然综述-遗传学》(Nature Reviews Genetics )杂志2011 年报道，5hmC 是基因转录激活的特征之一。在DNA 主动去甲基化过程中，5hmC 作为一个中间体，是由TET 酶介导的5mC 的氧化产物蛋白。5hmC 主要在全能性基因的外显子内部和靠近转录起始点附近富集，且该位点常伴有H3K4me3，因此5hmC 可看作转录激活的特征之一。《癌细胞》(Cancer Cell)、Trends Genet、Epigenomics 等杂志的多篇文献报道，5hmC 表达水平与肿瘤具有相关性。羟甲基化与包括癌症在内的多种疾病有关，且羟甲基化被报道在肿瘤组织中低表达。
2011 年《自然-生物技术》杂志(Nature biotechnol)报道了5hmC 检测技术——hmC-Seal。2016 年《细胞》杂志子刊《分子细胞》(Molecular Cell)报道了低输入量DNA 的5hmC 测序技术——Nano-hmC-Seal。优化技术Nano-hmC-Seal 可稳定重现不同DNA 输入量的结果，可适用DNA 总量范围：1ng ～100μg，在不同样本类型中均可实现检测的可能，满足液体活检低量cfDNA的检测要求。
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人肿瘤血中存在循环游离cfDNA 5hmC 生物标志物，不同来源的肿瘤(如肺、结肠、胃、肝、卵巢、胰腺)会释放不同的5hmC 修饰的cfDNA,而cfDNA 5hmC的检测技术能实现低至1ng DNA 的检测。低输入量DNA 的5hmC 测 序 技 术——Nano-hmC-Seal，只 需1ng DNA 即可进行表观测序，说明这一测序方法十分敏感，具有临床推广价值。刘杰团队随后用小鼠模型进行验证也获得了成功，当时提取的小鼠血量很少，却能够支持液体活检技术(表观测序技术)，这就为临床推广这项技术带来了很大的便利。这是因为，如果医生要求患者进行表观测序需要抽20 毫升血，患者必会有所抗拒，而只需抽1mL 血就能进行表观测序，患者应该愿意配合。
研究共纳入90 例健康人群，260 例肿瘤患者(包括80 例结直肠癌、71 例胃癌、25 例肝癌、34 例胰腺癌、46 例甲状腺癌等)，71 例胃肠良性病患者。研究者对5hmC 修饰在血浆cfDNA 和组织全基因组DNA 中均进行了检测。由于cfDNA 不单单是肿瘤释放的，更多是由免疫系统释放的，因此，研究监测目标是机体的整体免疫状况，同时对肝癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤均制定了诊断标准。
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刘杰教授发现，差异性的5hmC 位点是与肿瘤来源显著相关的。循环游离cfDNA 5hmC 表达谱与肿瘤组织及血细胞中全基因组DNA 5hmC 表达谱不全相同，其与DNA 不同的组织细胞来源有很大关系。差异性5hmC 在cfDNA 上的分布广泛且特异。肿瘤中基因表达的差异与5hmC 水平的差异密切相关，这就提示5hmC 对基因具有调控功能。他的研究团队进一步开展来源的相似性度量分析后发现，健康人与肠癌患者游离cfDNA 的差异性5hmC 分布在组蛋白修饰区与基因体区。以癌基因SULF1(sulfatase1) Gene 为例，健康人群和结肠癌患者血浆中存在明显差异5hmC 位点。
循环游离cfDNA 5hmC 可作为肠癌的有效诊断标志物(从discovery batch 中检测出989 个差异性5hmC位点)。来源于血浆中的游离cfDNA 5hmC 能够明显区分结直肠癌症患者和健康人群。在discovery batch 和validation batch 两组中，cfDNA 基因体的5hmC 改变具有更大的相关性，提示基因体的5hmC 位点可作为更稳定的肿瘤标志物。研究结果显示，结直肠癌、胃癌诊断率达到90%以上，于是他们进一步扩大样本进行验证。其后的初步研究结果显示，差异性cfDNA 5hmC 在结直肠癌诊断中的灵敏度、特异度可达80%～90%，能够实现结直肠癌的早期诊断；具有组织特异性，在胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌的预测概率均下降。
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循环游离cfDNA 5hmC 也可作为胃癌的有效诊断标志物(从discovery batch 中检测出1431 个差异性5hmC位点)。来源于血浆中的游离cfDNA 5hmC 能明显区分胃癌患者和健康人群。其后的初步研究结果也显示，差异性cfDNA 5hmC 在胃癌诊断中的灵敏度、特异度可达90%，能实现胃癌的早期诊断；具有组织特异性，在结直肠癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌的预测概率均下降。
为了验证肿瘤患者血浆中cfDNA 的5hmC 肿瘤相关性，刘杰团队利用PDX 模型验证其来源。利用5hmC 技术捕获PDX 模型血浆中人源的cfDNA 序列，胃癌、肠癌PDX 血浆中人源的cfDNA 序列比例明显比对照小鼠多。PDX 血浆中cfDNA 与供体肿瘤基因组DNA 二者的5hmC 表达谱之间的相关性与PDX 模型传代次数相关，传代次数越多，移植瘤越稳定。PDX模型中的血浆cfDNA 5hmC 与供体肿瘤DNA 5hmC 来源一致，患者血浆cfDNA 5hmC 表达水平与PDX 模型cfDNA 表达水平一致。
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在未来，临床医生有望通过液体活检对疾病进行诊断和治疗，ctDNA 液体活检将替代侵入组织活检(比如肝穿刺、肾穿刺、肺穿刺)，成为肿瘤诊断领域突破性的新技术。同时，液体活检对治疗也有帮助，比如肺癌EGFA 检测就可以给药，还可以进行靶向药治疗；但从另一方面来说，液体活检对诊断的价值还需要进一步提高，因为肿瘤不是单基因疾病，而是多基因疾病。
由于缺乏用于早期诊断的灵敏特异的生物标志物，临床上常会出现肝癌患者在癌症早期无明显症状，甚至患病后较长时间毫无知觉，从而导致常常错过最佳治疗期，一般就诊时已到中晚期，甚至已向肺部等处转移，临床预后差。目前运用传统检测方法，如甲胎蛋白(AFP)，在肝癌早期诊断中的价值十分有限，有40%的早期肝癌患者无法被检测出，成为影响我国肝癌死亡率的重要因素。因此，寻找新型的、高效的肝癌早期筛查方式显得尤为重要。
目前全球主流的DNA 测序都是分析特定DNA片段的碱基序列ATCG，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤的(G)排列方式。刘杰教授团队则进行了DNA 链上的开关功能测序，称为DNA 胞嘧啶(cytosine)表观遗传修饰。他认为，人体衰老及很多疾病尤其是免疫疾病的发生与基因开关有关，即病根在于调控开关不能打开，因此表观基因测序5hmC(5-羟甲基胞嘧啶)的测序技术非常关键。
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“如果临床医生把自己研究领域与新的技术进行交叉，对临床诊疗能带来很大的提高。”刘杰教授说。多年来他始终注重开展学科交叉研究，由此在国内较早开展了全基因组5hmC 测序。他曾与一位知名化学家合作开展学科交叉研究，共同开展973 课题，还积极开展了与物理学、材料学、人工智能的学科交叉研究。
6 年前，刘杰教授就与芝加哥大学开发DNA 修饰碱基5hmC 的检测和测序的化学家何川教授合作，研究如何进行5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)高通量检测技术技术转化。他们当时设计的项目是基于大数据的诊断结合人工智能技术。通过在临床收集近4000 例样本，经机器学习和大数据分析，利用肝癌样品和健康良性样品的差异基因建立5hmC 肝癌诊断模型。近期得出的研究结论是：5hmC 高通量检测技术最大的优势在于它能够实时监控癌症的状态，及时反映受检者是否罹患癌症，是一个真正具有实际意义的癌症早筛技术，可大幅提高肝细胞癌症检测的准确率(灵敏度达90%、特异性可达94%)，相信应用于临床不仅能提高肝癌的早期诊断率，还能及时监测肝癌的复发和转移。
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刘杰教授指出，在肿瘤治疗中，现在人们都盯着肿瘤这个“小偷”去开展研究，但小偷是各种各样经常变化的(肿瘤突变异质性和突变动态演化)，而且老盯着肿瘤去治疗，比如化疗，而忽视了对免疫系统的重要性是得不偿失的。就像靶向治疗，今天靶向治疗了一个小偷，明天后天又出来其他的小偷，是抓不完的，所以不如把自身免疫防线建设得很强大。他们目前的研究工作集中在肿瘤诊断研究方面，怎么从患者的免疫系统的状况来判定，免疫系统状况到哪一步患者可能要发生肿瘤了。刘杰教授同时提示，应重视生活习惯对免疫系统的影响，他最近接诊的3 名肿瘤患者都是62 岁，刚退休不久，这可能是人们改变生活习惯时会给免疫系统带来非常大的影响。目前该项技术在芝加哥大学、北京大学合成与功能生物分子中心、华山医院复旦大学消化疾病研究所、复旦大学附属中山医院、原第二军医大学第三附属医院东方肝胆外科医院等多家医院、研究机构正在进行多项研究合作。
人工智能精准治疗方案给肿瘤“个体化打击”
, 百拇医药 在肿瘤治疗方面，刘杰教授主要从他们团队三个方面的工作进行了介绍。一是精准方案选择——协同抗癌药物组合的高效筛选系统(RACS)；二是肿瘤免疫治疗(第四代分泌型CAR-T)；三是肿瘤新抗原疫苗(Neoantigen)。
第一，如何选择癌症精准治疗方案？可应用协同抗癌药物组合的高效筛选系统(RACS)。
刘杰教授团队和同济大学生命科学与技术学院曹志伟教授合作开发基于药靶网络和组学数据的协同抗癌药物组合的高效筛选系统(RACS)。这套人源性肿瘤移植动物模型(PDX)建立及方案筛选，将国际上的协同用药预测准确率从 61%提升到了78% (随机预测为 50%)。协同用药预测排序与标准排序的吻合度达0.78，该研究已申请了专利。
胃癌、肠癌、肝癌等各种癌症有差异，不同的肝癌患者也有差异，刘杰团队为每个患者个性化建成一个调控网络，根据调控网络，设计一个非常精准合理的给药方案，包括以哪些药物是阻断药，哪些药物起协同作用，这些药物怎么去阻断肿瘤又不影响免疫系统。任何药物理论上都可以筛选，比如针对胃癌可以筛选100 种药物。 通过研究现有的抗癌药物组合的靶点和癌症基因表达谱特征，采用机器学习算法，提取出具有协同作用的抗癌药物组合的网络靶向特征，并将其用于潜在协同药物组合的排序筛选。RACS 系统先后在B-细胞淋巴癌、乳腺癌和肺癌细胞系上分别进行了实验验证，并利用斑马鱼肿瘤模型，验证出一组具有强协同作用且低毒的抗乳腺癌协同药物组合。
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刘杰教授表示，RACS 是一个大规模的人工智能筛选系统，各种癌症都可以通过RACS 系统上筛选出上市药物。当输入患者的资料 ，就能提供一个用药指导方案，临床验证效果非常好，他们团队正在进一步完善这一系统。
第二，肿瘤免疫治疗——第四代分泌型CAR-T。
肿瘤治疗领域突破性进展主要体现在免疫治疗领域，肿瘤免疫治疗被《科学》(Science)评为2013 年“年度突破”之首。这种观点认为，机体免疫系统是抗肿瘤的前沿与核心，是当下肿瘤治疗领域最具前景的发展方向之一。
2018 年，免疫检查点抑制剂(PD-1/PDL1 抗体)摘得诺贝尔生理学或医学奖的桂冠，而免疫治疗的另一支主力——CAR-T 也迎来了多次重要发现与突破。CAR-T 抗击肿瘤的原理是给患者自身的免疫细胞T细胞加入一段外源基因，通过基因改造使其表面表达CAR 受体，CAR 受体上可以装上针对不同配体的“雷达”，从而使患者自身的免疫细胞能够识别不同的肿瘤，并将其消灭。其原理是经嵌合抗原受体修饰的T细胞能特异性识别靶抗原，并能脱离主要组织相容性复合体的限制，单独执行杀伤靶细胞的功能。
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《新英格兰医学杂志》(NEJM)在2013 年以及Annual review 杂志在2014 年报道，针对CD19 抗原的CAR-T 细胞对急性淋巴细胞白血病的完全缓解率超过90%。实际上，目前CAR-T 免疫治疗大多都是针对血液系统肿瘤，那么对实体瘤怎么治疗呢？肿瘤细胞可通过PD-1 等免疫检查点抑制T 细胞杀伤功能；阻断该分子就能激活T 细胞。已有靶向PD-1 和CTLA-4的四种抗体药物获批上市，治疗非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤等。目前全球登记临床试验已达到237 项(Clinicaltrials.gov)。比 如，KEYNOTE-001 研 究 针 对PD-1 单抗，治疗非小细胞肺癌495 例，PD-L1 <50%，ORR 19.4%，PFS 3.7 个 月。NCT01295827 研 究 针 对PD-1 单抗，治疗晚期恶性黑色素瘤173 例，ORR 26%。
嵌合抗原受体修饰的T 细胞(CAR-T)根据不同的胞内信号转导结构域可分为：第一代CAR-T：仅包含CD3-zeta；第二代CAR-T：包括CD3-zeta 和一种共刺激分子结构域；第三代CAR-T：包含CD3-zeta和两种共刺激分子结构域，因为T 细胞活化需要两个信号。综合2010 至2014 年Molecular therapy 杂志等文献发现，CAR-T 治疗实体瘤效果不佳的原因主要有：一是生物屏障，经静脉回输的CAR-T 细胞要发挥治疗作用，必须通过血液循环系统，趋向到肿瘤部位，只有少量CAR-T 细胞能最终靶向肿瘤部位并接触到抗原丰富的肿瘤组织；二是免疫抑制微环境，调节性T细胞(Treg)等细胞及其分泌的细胞因子，如IL-10 可以通过直接或间接的方式抑制T 细胞的功能。基因修饰途径以逆转录病毒介导易造成基因组突变，持续表达易造成严重副作用。
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在过去的几年里，CAR-T 细胞疗法与双特异性抗体疗法使T 细胞能有效地靶向CD19 等抗原，使罹患B 细胞恶性癌症的患者得到了极好的缓解，也为肿瘤免疫疗法领域带来了革新。2011 年至2013 年Expert Opin Biol Ther 等杂志发表的文献显示，双特异性T 细胞连接子(BiTEs)，利用单链双特异性抗体技术将同一或不同细胞上两种单克隆抗体(抗原表位)连接起来。局限性为半衰期短，内源的效应T 细胞不足以及严重副作用。
第四代实体瘤CART 的研制由刘杰教授团队和储以微教授团队开展。体内实验：裸鼠皮下荷瘤胃癌细胞，第8、14、20 天静脉注射HER2-CART 细胞，HER2-CART 显著抑制肿瘤生长，延长裸鼠生存期。第四代GPC3-CAR 结构以CD3 抗体代替传统CAR的胞内段，并mRNA 电转T 细胞表达。目前研究已完成并发表了相关论文。
第三，“肿瘤新抗原”疫苗比CAR-T 治疗更安全。
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刘杰教授团队开展的另一项工作是国家基金委的重点项目——新抗原疫苗的研制工作。研发流程主要包括以下四个方面。一是新抗原人工智能预测。基于人工智能与表位肽预测融合排序，构建肿瘤个体化抗原肽组合疫苗。二是新抗原免疫功能评估。体内外实验确定新抗原肽的免疫原性以及特异性。三是新抗原疫苗临床试验。设计新抗原肽组合疫苗Ⅰ期临床试验，验证其安全性和有效性。四是新抗原肽组合疫苗注射前后T 细胞发生变化的机制研究。目前该项研究的结果已经发布。
2017 年7 月13 日《自然》(Nature)杂志同一天发布两项基于新抗原的个体化肿瘤疫苗研究，文章结论是肿瘤新抗原临床应用安全、可行且疗效明显。《自然》(Nature，2017 年7 月)报道6 例晚期恶性黑色素瘤接受Neoantigen 对应的抗原肽制备的疫苗治疗，其中4 例注射后25 个月维持无复发，2 例注射后出现复发者接受PD-1 抗体治疗后完全缓解。Nature 杂志(2017 年)报道13 例晚期黑色素瘤注射neoantigen 对应RNA 制备的个体化疫苗后，无复发生存期明显延长。
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肿瘤新抗原(neoantigen)是由肿瘤细胞基因变异产生，是一种位于肿瘤细胞表面主要组织相容性复合物的抗原表位肽(8～12 肽)，不存在于正常组织。具有强免疫原性，使免疫学会识别其为“非我”抗原。新抗原(neoantigen)可为提升肿瘤疫苗的疗效提供帮助。那么，新抗原人工智能预测又是什么？它是基于人工智能与表位肽预测融合排序系统构建肿瘤个体化抗原肽组合。肿瘤特异性突变筛选，原代肿瘤细胞寻找非同义突变，外周血单个核细胞PBMC 进行HLA Ⅰ、Ⅱ分型，人工智能SEPPA，抗原表位与HLA 亲和力预测。CE-BLAST 抗原表位识别TCR 相似度预测，再通过融合排序系统的突变嵌合亲和力差异、基因表达水平、TCR 结合概率、肿瘤突变负荷、基因功能评估、阴性过滤等计算规则，获得潜在新抗原肽组合。
为什么现在能研制肿瘤新抗原疫苗而以前不能？刘杰教授认为，这是因为人工智能和大数据出现之前，很多抗原都是正常细胞有而肿瘤表达高的相关抗原；而借助人工智能和大数据后，就能找到健康细胞没有而肿瘤细胞有的抗原表位肽(8～12 肽)，找到后进行大量的排序和人工智能评估，观察是否有体外激活功能，再通过制备疫苗进行机体免疫治疗，在切除肿瘤后立刻进行治疗预防双管齐下，注射特异性的新抗原疫苗。通过这项免疫技术治疗非常安全，效果较为理想，而CAR-T 治疗尚无法避免细胞因子风暴的产生。
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专家小传
刘杰教授，复旦大学附属华山医院消化科主任、博士生导师、教授、主任医师。擅长癌前病变的早期预警及干预、消化肿瘤的综合诊治及康复，消化系统疑难杂症。国家“长江学者”奖励计划特聘教授；国家“杰出青年基金”获得者；国家人事部新世纪百千万人才工程“国家级人选”；国家教育部“新世纪优秀人才”资助计划获得者；上海市“优秀学科带头人”及上海市“领军人才”。复旦大学消化疾病研究所所长，复旦大学生物医学研究院双聘教授。留学美国Thomas Jefferson 大学6 年。主要从事临床疑难病例研究及消化肿瘤的综合诊治，包括肿瘤的早期预警，肿瘤高危患者筛选及干预，肿瘤患者的个体化精准综合治疗及康复方案选择。克隆出国际上未见报道的肝硬化癌变早期预警新基因，具有重要的癌变预警价值；率先建立核酸适配体筛选平台并鉴定出抗胃癌、肝癌和乙肝特异性核酸适配体，填补本领域国内空白，提供了肿瘤早诊及抗乙肝新药创制全新策略；临床研究中积极走转化医学之路，在Nature 子刊发表的临床病例研究被美国医师协会推举为继续医学教育教材。利用模糊数学理论建立了胃癌前病变癌变概率的判别模式，对高危癌前病变的判定具有重要价值。先后获得世界胃肠病学大会“青年医师奖”、省级“十大杰出青年” 、赛克勒中国医师“年度奖”、上海市“优秀学科带头人” 、教育部“长江学者”特聘教授等荣誉。, 百拇医药(文图 中国医药科学 费菲)