杨振苹 张静静 邢体坤 王 斌 宋路萍 荆新蕊 宋彦君 黄 帅 王亚萍 潘若文▲

    1.华兰生物工程股份有限公司研发中心，河南新乡 453003；2.华兰基因工程有限公司质量控制部，河南新乡 453000

    近年来，建立在DNA基础上的基因疗法和DNA疫苗已成为一个热门的研究方向，有望成为解决全球卫生问题的最有前景的方法之一。与重组病毒比较，重组质粒因具有免疫原性低、安全等特点而占有更大的优势。

    质粒(plasmid)是独立于染色体外的双链闭合环状DNA分子，大小范围为0.8～120kb，具有自主复制和转录能力，常以超螺旋状态存在，广泛存在于细菌、放线菌和真菌中[1]。质粒作为基因工程的常用载体，能够将目的基因通过DNA重组技术转入宿主细胞中。

    内毒素(Endotoxin)最早于十九世纪由Richard Pfeiffer在研究发热物质过程中发现并提出[2]。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜上的特有结构，其主要化学成分是脂多糖。脂多糖由核心寡糖、杂多糖链、菌株特异性O抗原和疏水的脂质A组成，其中脂质A是其主要的活性位点[3]。研究表明，内毒素是诱发炎症反应、胰岛素抵抗、肺损伤等的主要致病成分[2，4-5]，对哺乳类动物有显著的致热性[6]。内毒素的检测常用家兔热源法和鲎试剂法[7]，其中，鲎试剂法是目前最常用的方法，已被列入《中华人民共和国药典》[8]。

    由于试验目的不同，质粒DNA的质量也有不同的要求，尤其是在细胞转染的过程中，质粒中的内毒素水平会明显影响细胞的转染效率，所以对质粒的质量要求更为苛刻。而面对市售的种类繁多的质粒DNA提取试剂盒，正确的选择会成为试验成功的关键。本研究选取了四种市售的去内毒素试剂盒进行质粒提取，并用鲎试剂凝胶法和动态浊度法测定所提质粒DNA的内毒素水平，为细胞转染用质粒DNA提取试剂盒的选择提供依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    质粒pCGS3保存于华兰生物工程股份有限公司实验室，DH5α感受态细胞购自生工生物工程股份有限公司。

    1.2 试剂

    四种去内毒素试剂盒为：(A)Thermo公司的GeneJET Endo-Free Plasmid Maxiprep Kit，货号：K0861；(B)生工的UNIQ-500无内毒素质粒大量提取试剂盒，货号：B511249；(C)QIAGEN的EndoFree Plasmid Maxi Kit ......