宋路萍 杨振苹 王 斌 邢体坤 郝一楠 江 魁 王亚萍 黄 帅 张静静▲

    1.华兰生物工程股份有限公司研发中心，河南新乡 453003；2.华兰基因工程有限公司质量控制部，河南新乡 453000

    微生物污染是制药企业生产过程控制及药品质量评估的重要指标，也是影响消费者用药安全的关键因素[1]。美国FDA公布的药品召回事件中，由微生物污染风险引起的召回事件占到了49%以上[2]。药品微生物控制是药品安全性保障的重要措施。因此加强药品生产过程微生物监管和风险控制是保障药品质量、降低用药风险的重要途径[3]。在药品生产的微生物质量控制中，实现微生物“属”及“种”水平的准确鉴定，对控制药品质量以及保障消费者用药安全具有重要意义[4-5]。随着分子生物学技术的快速发展，微生物鉴定技术也得到飞速发展。近年来，各种基因诊断技术在细菌检测中不断开发、利用，尤其是基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的基因诊断技术发挥着越来越重要的作用，是细菌鉴定技术发展的主要趋势。研究表明，在细菌细胞中RNA碱基的变化比整个基因组的变化要慢得多，保守得多，这是因为RNA的功能一直没有发生变化。因此有细菌“活化石”之称[6]。现代微生物学中,利用16S rDNA序列来鉴定细菌的种类以及分析它们之间的进化关系正在被成功运用。基因型鉴定技术如16S rRNA序列比对方法可以鉴定多数细菌，已得到广泛应用[7-8]。但有研究表明，16S rRNA序列比对方法和RiboPrinter微生物鉴定系统，对一些近缘菌种有一定的鉴定局限性[9-10]。

    1 材料与方法

    1.1 供试品

    细胞培养物中分离的未知菌种(编号为JY-01)与已知菌种(编号为JY-02)，由华兰生物工程股份有限公司研发中心提供。

    1.2 材料信息

    Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物，Taq Plus DNA聚合酶、琼脂糖H、4S Red Plus核酸染色剂(10 000 ×水 溶 液)购 自 BBI，GeneRuLer DNA Ladder Mix 购自 Thermo Scientific。Taq Plus DNA 聚 合 酶、10×PCR Buffer(含 Mg2+)、dNTP(10mM)、灭菌去离子水购自生工生物 ......