崔自重

    ( 长沙市第三医院 湖南 长沙 410015)

    黑色素瘤是起源于皮肤黑素细胞的常见皮肤肿瘤，具有恶性程度高、转移快、预后差等特点。随着该疾病在我国的发病率急速增加，病死率也呈现一定的上升趋势[1]。黑色素瘤放化疗疗效欠佳，多以手术切除为主。但单纯手术也不能很好提升患者的生存期，分子生物学技术是今后肿瘤治疗的主要方向。肿瘤的生物治疗通过RNA 干扰或特异性沉默肿瘤诱发基因来影响肿瘤细胞与外基质的黏附，从而抑制肿瘤生长[2]。Pim-1 是一种保守的丝氨酸或苏氨酸蛋白激酶基因，主要通过磷酸化途径使底物特异性的失活，从而促进癌细胞的增殖。已有研究发现，Pim-1 在黑色素瘤患者体内表达非常活跃，表明该基因对B16 细胞的生物学行为具有一定影响。

    1.材料与方法

    1.1 细胞与试剂

    2019 年3 月—10 月期间进行实验研究。人黑色素瘤细胞(B16)由长沙医学院新型药物制剂研发湖南省重点实验室培育基地(平台编号2016TP1029)提供；新生牛血清购于济南劲牛生物科技有限公司；凋亡检测试剂盒和细胞总蛋白提取试剂盒购于上海贝博生物试剂公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)购于Sigma公司，二甲基亚砜(DMSO)购自于国药集团化学试剂有限公司；Pim-1 抗体(1:1000)、Bax(1:1000)抗体、Bad(1:1000)抗体均购于Abcam 公司(中国)。

    1.2 分组方法

    取人黑色素瘤细胞，根据是否沉默Pim-1 基因分为对照组和试验组。对照组(B16 细胞)：取B16 细胞用含有10.0%胎牛血清的RPMI 1640 培养液(含浓度100μ/mL 青霉素、链霉素。pH=7.2 ～7.4)在37℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养和传代。试验组(转染B16 后沉默Pim-1 基因)：同样用含有10.0%胎牛血清的RPMI 1640 培养液进行培养，培养条件同对照组。待细胞完全贴壁后，吸出各孔培养液，加入100μL不含牛血清的培养基，再加入Pim-1 基因。感染时间为90min，每15min 轻微晃动培养液一次。90min 后吸出无血清的培养液，置于37℃、5.0% CO2的饱和湿度培养箱中培养和传代[3-4] ......