温阳补肾方含药血清对破骨细胞凋亡率及RANK蛋白的影响(2)
2.3 流式细胞术检测各组破骨细胞凋亡率 将破骨细胞接种于6孔培养板,共接种24孔,加入各组培养基后培养48 h。将各组细胞培养液吸出至各个BD管内,再用PBS洗涤细胞1次,加入适量胰酶细胞消化液(不含有EDTA)消化细胞。室温孵育2 min,轻轻将贴壁破骨细胞吹打下来,防止过度消化,迅速将细胞混悬液移入有培养液的流式管,3000 r·min-1离心3 min后弃上清,收集细胞,用PBS轻轻重悬细胞并计数。取3×105重悬的细胞,1000 r·min-1离心5 min后弃上清,加入500 μL Binding Buffer混匀后,加入5 μL Annexin V-FITC,再加入5 μL Propidium Iodide混匀;室温避光反应10 min;60 min内进行流式细胞仪检测细胞凋亡率。2.4 RANK蛋白测定 各组接种于6孔板,每组6孔,各组含药血清培养48 h后,用细胞刮刀将细胞移入蛋白裂解液。加入5X SDS-PAGE loading buffer,水煮变性蛋白,冷却后-20 ℃保存备用。经蛋白定量后 ......
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