免疫组织化学技术检测新生乳鼠颞下颌关节软骨基质与Ihh表达的实验研究(1)
【摘 要】目的：探讨颞下颌关节发育的分子生物学机制。方法：选取5只BAL B/C新生乳鼠，取头，常规固定、脱钙、脱水、包埋，采用免疫组织化学技术检测颞下颌关节CollagenⅡ(ColⅡ)、CollagenⅠ(ColⅠ)、Aggrecan和印度豪猪蛋白(Ihh)的表达。结果：颞下颌关节盘中，ColⅠ和ColⅡ表达阳性，Ihh表达强阳性，Aggrecan未见明显表达；髁状突软骨中，ColⅡ表达阳性，Aggrecan表达强阳性，Ihh和ColⅠ少量表达。结论：ColⅡ、ColⅠ、Aggrecan和Ihh正常表达，在颞下颌关节形成与发育过程中发挥重要的作用。
【关键词】 颞下颌关节；软骨基质；免疫组织化学技术；印度豪猪蛋白；小鼠
Experimental Study on the Temporomandibular Joint Cartilage Matrix and the Expression of Ihh in Newborn Rats by Immunohistochemical Technique
SHAO Xiang，CHEN Hou-huang，CHEN Da，MA Yu-huan，ZHENG Wen-wei，YE Hong-zhi，LI Xi-hai
【ABSTRACT】Objective：To investigate the molecular mechanism of the development of temporomandibular
joint.Methods：Heads of five BAL B/C newlyborn rats were taken，fixed，decalcified，dehydrated and embedded.Immunohistochemical technique was used to detect the expressions of CollagenⅡ(ColⅡ)，CollagenⅠ
(ColⅠ)，Aggrecan and Ihh.Results：In the temporomandibular joint disk，the expressions of ColⅠ and ColⅡ
were positive，the expression of Ihh was strongly positive and Aggrecan had no obvious expression；while in condylar cartilage，the expression of ColⅡ was positive，the expression of Aggrecan was strongly positive，and Ihh and ColⅠ had a little expression.Conclusion：ColⅡ，ColⅠ，Aggrecan and Ihh have normal expressions，playing an important role in the formation and development of the temporomandibular joint.
【Keywords】 temporomandibular joint；cartilage matrix；Immunohistochemical technique；Ihh；mouse
颞下颌关节(temporomandibular joint，TMJ)由下颌骨的下颌头关节面、颞骨的下颌窝和关节结节关节面、关节囊、关节腔，以及将关节腔分为上、下两部分的关节盘组成[1]，多种因素参与影响颞下颌关节的生长发育[2-3]，了解颞下颌关节的生长发育过程，对深入研究颌面部畸形的发病机制有着重要的临床意义。小鼠的颞下颌关节基本结构与人相似，但下颌骨升支端有髁状突、喙突与角突，其中只有髁状突参与构成颞下颌关节。目前，颞下颌关节的结构和功能已有系统的描述，但其发育相关的分子生物学机制有待深入研究[4-5]。因此，本研究以新生乳鼠颞下颌关节为研究对象，采用免疫组织化学技术，观察小鼠发育过程中颞下颌关节软骨基质与印度豪猪蛋白(Ihh)的表达变化，为揭示颞下颌关节发育机制提供新的
途径。
1 材料与方法
1.1 实验动物 BAL B/C新生乳鼠5只，上海斯莱克实验动物有限责任公司购买雌性孕鼠生产，动物合格证号：SCXK(沪)字第2012-0002号。实验室室温恒定(22±1)℃，湿度(56±5)%，紫外线定期消毒，自由摄食饮水，给予质量分数为0.3%的钠饮食。
1.2 试剂和仪器 磷酸盐缓冲液(PBS，pH = 7.4，美国Hyclone公司)；Ihh(1∶200；ab39634)、ColⅡ(1∶200；ab53047)、ColⅠ(1∶500；ab34710)和蛋白聚糖(Aggrecan)(1∶500；ab36861)抗体(美国Abcam公司)；枸橼酸盐缓冲液(pH = 6.0，美国Sigma公司)；山羊血清，通用型二步法检测试剂盒(含质量分数为3%的过氧化氢去离子水和多聚辣根酶标记羊抗兔IgG即二抗)以及DAB显色试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)；光学显微镜(德国徕卡公司)；石蜡切片机(德国徕卡公司)；生物组织石蜡包埋机(孝感亚光医用电子技术有限公司)。
1.3 取 材 空气栓塞法处死新生乳鼠，立即放入PBS中，取下头部置于质量分数为4%的多聚甲醛4 ℃ 固定24 h，Kristense液脱钙1周，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片备用。
1.4 免疫组织化学技术染色 室温下石蜡组织切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，将切片放入 (邵翔 陈后煌 陈达 马玉环 郑文伟 叶蕻芝 李西海)
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Experimental Study on the Temporomandibular Joint Cartilage Matrix and the Expression of Ihh in Newborn Rats by Immunohistochemical Technique
SHAO Xiang，CHEN Hou-huang，CHEN Da，MA Yu-huan，ZHENG Wen-wei，YE Hong-zhi，LI Xi-hai
【ABSTRACT】Objective：To investigate the molecular mechanism of the development of temporomandibular
joint.Methods：Heads of five BAL B/C newlyborn rats were taken，fixed，decalcified，dehydrated and embedded.Immunohistochemical technique was used to detect the expressions of CollagenⅡ(ColⅡ)，CollagenⅠ
(ColⅠ)，Aggrecan and Ihh.Results：In the temporomandibular joint disk，the expressions of ColⅠ and ColⅡ
were positive，the expression of Ihh was strongly positive and Aggrecan had no obvious expression；while in condylar cartilage，the expression of ColⅡ was positive，the expression of Aggrecan was strongly positive，and Ihh and ColⅠ had a little expression.Conclusion：ColⅡ，ColⅠ，Aggrecan and Ihh have normal expressions，playing an important role in the formation and development of the temporomandibular joint.
【Keywords】 temporomandibular joint；cartilage matrix；Immunohistochemical technique；Ihh；mouse
颞下颌关节(temporomandibular joint，TMJ)由下颌骨的下颌头关节面、颞骨的下颌窝和关节结节关节面、关节囊、关节腔，以及将关节腔分为上、下两部分的关节盘组成[1]，多种因素参与影响颞下颌关节的生长发育[2-3]，了解颞下颌关节的生长发育过程，对深入研究颌面部畸形的发病机制有着重要的临床意义。小鼠的颞下颌关节基本结构与人相似，但下颌骨升支端有髁状突、喙突与角突，其中只有髁状突参与构成颞下颌关节。目前，颞下颌关节的结构和功能已有系统的描述，但其发育相关的分子生物学机制有待深入研究[4-5]。因此，本研究以新生乳鼠颞下颌关节为研究对象，采用免疫组织化学技术，观察小鼠发育过程中颞下颌关节软骨基质与印度豪猪蛋白(Ihh)的表达变化，为揭示颞下颌关节发育机制提供新的
途径。
1 材料与方法
1.1 实验动物 BAL B/C新生乳鼠5只，上海斯莱克实验动物有限责任公司购买雌性孕鼠生产，动物合格证号：SCXK(沪)字第2012-0002号。实验室室温恒定(22±1)℃，湿度(56±5)%，紫外线定期消毒，自由摄食饮水，给予质量分数为0.3%的钠饮食。
1.2 试剂和仪器 磷酸盐缓冲液(PBS，pH = 7.4，美国Hyclone公司)；Ihh(1∶200；ab39634)、ColⅡ(1∶200；ab53047)、ColⅠ(1∶500；ab34710)和蛋白聚糖(Aggrecan)(1∶500；ab36861)抗体(美国Abcam公司)；枸橼酸盐缓冲液(pH = 6.0，美国Sigma公司)；山羊血清，通用型二步法检测试剂盒(含质量分数为3%的过氧化氢去离子水和多聚辣根酶标记羊抗兔IgG即二抗)以及DAB显色试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)；光学显微镜(德国徕卡公司)；石蜡切片机(德国徕卡公司)；生物组织石蜡包埋机(孝感亚光医用电子技术有限公司)。
1.3 取 材 空气栓塞法处死新生乳鼠，立即放入PBS中，取下头部置于质量分数为4%的多聚甲醛4 ℃ 固定24 h，Kristense液脱钙1周，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片备用。
1.4 免疫组织化学技术染色 室温下石蜡组织切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，将切片放入 (邵翔 陈后煌 陈达 马玉环 郑文伟 叶蕻芝 李西海)
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