补肾活血方调节miRNA—140—5p表达干预人原代软骨细胞退变的研究(2)
2.2 细胞培养和造模 收集在本单位骨科手术室进行膝关节置换手术的患者(年龄65岁以上)的关节软骨，迅速转移至细胞培养室，按照本实验室的传统做法[8]分离和培养人原代软骨细胞。将培养的第2代人软骨细胞按每孔3×105个细胞种植于细胞培养6孔板，继续培养至细胞融合度达到80%左右时弃去培养基，并且用DPBS洗2次后，分为以下3组：空白对照组只添加高糖DMEM培养基和10%大鼠空白血清；模型对照组添加高糖DMEM培养基和10%大鼠空白血清，并且加入10 ng·mL-1 IL-1β；含药血清组添加高糖DMEM培养基和10%大鼠含药血清，并且加入10 ng·mL-1IL-1β。以上各组细胞设3个复孔，继续培养24 h后收集各组细胞。
2.3 反转录合成First-strand cDNA 首先采用Trigol，氯仿，异丙醇和75%乙醇等试剂提取软骨细胞总RNA，然后将RNA反转录合成第一链cDNA。其中U6和miRNA-140-5p的First-strand cDNA合成中分别加入各自的RT引物 ......
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2.3 反转录合成First-strand cDNA 首先采用Trigol，氯仿，异丙醇和75%乙醇等试剂提取软骨细胞总RNA，然后将RNA反转录合成第一链cDNA。其中U6和miRNA-140-5p的First-strand cDNA合成中分别加入各自的RT引物 ......
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