冠心病患者血小板miR—223和miR—96差异表达与氯吡格雷反应性的关联研究
【摘要】目的 探讨冠心病患者血小板RNA miR-223与miR-96差异表达水平及其与氯吡格雷反应性间的关系。方法 不稳定型心绞痛(UAP)患者36例，根据血小板反应指数(PRI)分组，PRI<56%为A组，≥56%为B组，各18例。检测两组患者的血小板聚集率、血小板miR-223及miR-96表达，并分析其与血小板聚集率及PRI间的关系。结果 A组的miR-223表达显著高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)，两组miR-96表达差异无统计学意义(P>0.05)；miR-223与PRI呈显著负相关性，差异有统计学意义(P<0.05)，而miR-96表达与PRI之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 冠心病患者的血小板miR-223低表达与氯吡格雷治疗后血小板反应性显著相关，对于个体化抗血小板治疗具有指导意义。
【关键词】冠心病；血小板反应性；氯吡格雷抵抗
【中图分类号】R541.4 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-6681.2015.01.00.02
血小板活化聚集是冠心病的主要病理生理基础，临床研究表明，在阿司匹林联合肝素治疗的同时，加用氯吡格雷能够进一步提高疗效。但即便应用氯吡格雷后，仍有部分患者再发冠状动脉事件[1]。故在冠心病治疗中，氯吡格雷抵抗成为临床研究的重要内容。本研究探讨了冠心病患者微小血小板RNA miR-223与miR-96表达水平及其与氯吡格雷反应性间的关系，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2010年1月～2014年1月我院收治的UAP患者36例，均在采血前24 h口服阿司匹林300 mg+氯吡格雷300 mg，术后按照100 mg/次、75 mg/次双重抗血小板治疗。根据PRI水平分组，PRI<56%为A组，≥56%为B组。A组18例，男10例，女8例，年龄36～75岁，平均年龄(63.2±2.7)岁；B组18例，男8例，女10例，年龄40～72岁，平均年龄(64.1±2.9)岁。两组性别与年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。
1.2 方法
患者均于入院后次日晨取空腹外周静脉血15 mL，抗凝后于室温下以200 g离心10 min，留取PRP然后以1500 g离心10min。以1%EDTA和0.1%BAS混合液1 mL冲洗，再次离心，重复3次提纯。常规进行除白细胞纯化血小板，采用TRizol试剂提取血小板总RNA，获得上层水相后继续提取，最终获得miRNA。采用基座模式进行RNA浓度测定，并进行RNA变性电泳，检测纯化血小板中的白细胞水平及miRNA水平。
1.3 统计学分析
数据以统计学软件SPSS 18.0分析，以“x±s”表示计量资料，采用t检验，相关性采用Spearman相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 血小板聚集率
A组的血小板聚集率平均为(36.71±15.26)%，显著高于B组的(52.21±13.15)%，差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2 miR-223及miR-96表达
所有样本的miR-223及miR-96均获得扩增，且其溶解曲线呈现单峰。A组miR-223表达显著高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)，两组miR-96表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳分析均表现为单一扩增条带。
2.3 miR-223、miR-96表达与血小板聚集率以及PRI的关系
采用Spearman相关性分析表明，miR-223及miR-96表达均与血小板聚集率之间无明显相关性(r=0.0341、0.1475，P<0.05)；miR-223与PRI呈显著负相关性(r=-0.4129，P<0.05)，而miR-96表达与PRI差异无统计学意义(r=-0.0184，P>0.05)。
3 讨 论
ACC/AHA提出经皮冠状动脉介入治疗指南中指出，对于血小板聚集率<50%者，应考虑将氯吡格雷的维持剂量由75 mg提高至150 mg。认为对于抗血小板疗效不理想的患者，予以个体化抗栓治疗是科学合理的，但盲目地加大氯吡格雷维持剂量则不合理[2]。因此，评估患者的血小板功能，从而前瞻性地评价氯吡格雷反应性及疗效非常必要。
miRNA在血小板基因调控过程中具有关键性作用，miRNA基因效应调节能够获得特异性的疗效，或为疾病的治疗提供更为有效的途径。分析不同疾病状态下患者的miRAN表达谱差异，能够筛选出特异性及灵敏度更高的miRAN，为疾病的诊断与基因治疗提供标志物或者靶标[3-4]。本研究对UAP患者采用氯吡格雷治疗，检测了治疗后不同血小板活性条件下miRNA的相对表达水平。结果显示，血小板中存在miR-223
及miR-96，且在高反应性状态下呈现表达下调。尤其是miR-223表达下调非常明显，与PRI之间呈显著负相关性，与刘继文等[5]报道一致。miR-96虽然在高反应状态下也呈现表达下调，但下调并不明显，且其与PRI之间并无明显相关性。
综上所述，miR-223与miR-96能够作为血小板活性评估的潜在标志物，miR-223低表达与冠心病患者的血小板高反应性显著负相关，其相对差异表达对于临床个体化地评估患者的血小板活性反应，指导临床治疗。
参考文献
[1]何凌云.氯吡格雷对糖代谢异常冠心病患者血小板P选择素表达的影响及与预后的关系[J].中国医刊，2011，46(11)：54-55.
[2]刘 洁，杨 进，银剑斌，等.氯吡格雷抵抗患者的临床指标、血小板抑制率及P选择素的比较分析[J].临床荟萃，2013，28(7)：818-821.
[3]高清江，吕 璐，王 梅，等.冠状动脉介入治疗术后三联抗血小板治疗对冠心病合并糖尿病患者的影响[J].临床荟萃，2014，29(12)：1334-1338.
[4]杨 帆，王 红，谭保平，何柳平.抗血小板治疗对糖尿病患者冠状动脉支架术后血小板CD62P的影响[J]. 中华实用诊断与治疗杂志，2013，4：330-332.
[5]刘继文，程晓曙，杨人强，等.急性冠脉综合征患者抗血小板药物疗效和对氯吡格雷的反应性[J].中国循环杂志，2008，23(3)：189-192. (朱华强)
【关键词】冠心病；血小板反应性；氯吡格雷抵抗
【中图分类号】R541.4 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-6681.2015.01.00.02
血小板活化聚集是冠心病的主要病理生理基础，临床研究表明，在阿司匹林联合肝素治疗的同时，加用氯吡格雷能够进一步提高疗效。但即便应用氯吡格雷后，仍有部分患者再发冠状动脉事件[1]。故在冠心病治疗中，氯吡格雷抵抗成为临床研究的重要内容。本研究探讨了冠心病患者微小血小板RNA miR-223与miR-96表达水平及其与氯吡格雷反应性间的关系，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2010年1月～2014年1月我院收治的UAP患者36例，均在采血前24 h口服阿司匹林300 mg+氯吡格雷300 mg，术后按照100 mg/次、75 mg/次双重抗血小板治疗。根据PRI水平分组，PRI<56%为A组，≥56%为B组。A组18例，男10例，女8例，年龄36～75岁，平均年龄(63.2±2.7)岁；B组18例，男8例，女10例，年龄40～72岁，平均年龄(64.1±2.9)岁。两组性别与年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。
1.2 方法
患者均于入院后次日晨取空腹外周静脉血15 mL，抗凝后于室温下以200 g离心10 min，留取PRP然后以1500 g离心10min。以1%EDTA和0.1%BAS混合液1 mL冲洗，再次离心，重复3次提纯。常规进行除白细胞纯化血小板，采用TRizol试剂提取血小板总RNA，获得上层水相后继续提取，最终获得miRNA。采用基座模式进行RNA浓度测定，并进行RNA变性电泳，检测纯化血小板中的白细胞水平及miRNA水平。
1.3 统计学分析
数据以统计学软件SPSS 18.0分析，以“x±s”表示计量资料，采用t检验，相关性采用Spearman相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 血小板聚集率
A组的血小板聚集率平均为(36.71±15.26)%，显著高于B组的(52.21±13.15)%，差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2 miR-223及miR-96表达
所有样本的miR-223及miR-96均获得扩增，且其溶解曲线呈现单峰。A组miR-223表达显著高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)，两组miR-96表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳分析均表现为单一扩增条带。
2.3 miR-223、miR-96表达与血小板聚集率以及PRI的关系
采用Spearman相关性分析表明，miR-223及miR-96表达均与血小板聚集率之间无明显相关性(r=0.0341、0.1475，P<0.05)；miR-223与PRI呈显著负相关性(r=-0.4129，P<0.05)，而miR-96表达与PRI差异无统计学意义(r=-0.0184，P>0.05)。
3 讨 论
ACC/AHA提出经皮冠状动脉介入治疗指南中指出，对于血小板聚集率<50%者，应考虑将氯吡格雷的维持剂量由75 mg提高至150 mg。认为对于抗血小板疗效不理想的患者，予以个体化抗栓治疗是科学合理的，但盲目地加大氯吡格雷维持剂量则不合理[2]。因此，评估患者的血小板功能，从而前瞻性地评价氯吡格雷反应性及疗效非常必要。
miRNA在血小板基因调控过程中具有关键性作用，miRNA基因效应调节能够获得特异性的疗效，或为疾病的治疗提供更为有效的途径。分析不同疾病状态下患者的miRAN表达谱差异，能够筛选出特异性及灵敏度更高的miRAN，为疾病的诊断与基因治疗提供标志物或者靶标[3-4]。本研究对UAP患者采用氯吡格雷治疗，检测了治疗后不同血小板活性条件下miRNA的相对表达水平。结果显示，血小板中存在miR-223
及miR-96，且在高反应性状态下呈现表达下调。尤其是miR-223表达下调非常明显，与PRI之间呈显著负相关性，与刘继文等[5]报道一致。miR-96虽然在高反应状态下也呈现表达下调，但下调并不明显，且其与PRI之间并无明显相关性。
综上所述，miR-223与miR-96能够作为血小板活性评估的潜在标志物，miR-223低表达与冠心病患者的血小板高反应性显著负相关，其相对差异表达对于临床个体化地评估患者的血小板活性反应，指导临床治疗。
参考文献
[1]何凌云.氯吡格雷对糖代谢异常冠心病患者血小板P选择素表达的影响及与预后的关系[J].中国医刊，2011，46(11)：54-55.
[2]刘 洁，杨 进，银剑斌，等.氯吡格雷抵抗患者的临床指标、血小板抑制率及P选择素的比较分析[J].临床荟萃，2013，28(7)：818-821.
[3]高清江，吕 璐，王 梅，等.冠状动脉介入治疗术后三联抗血小板治疗对冠心病合并糖尿病患者的影响[J].临床荟萃，2014，29(12)：1334-1338.
[4]杨 帆，王 红，谭保平，何柳平.抗血小板治疗对糖尿病患者冠状动脉支架术后血小板CD62P的影响[J]. 中华实用诊断与治疗杂志，2013，4：330-332.
[5]刘继文，程晓曙，杨人强，等.急性冠脉综合征患者抗血小板药物疗效和对氯吡格雷的反应性[J].中国循环杂志，2008，23(3)：189-192. (朱华强)