调查分析河南省肉禽和蛋禽中弓形虫的感染状况(1)
【中图分类号】R382.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851(2018)07--01
1 前言
刚地弓形虫可以感染人类和鸟类等动物，是常见寄生虫。人或动物通过摄入被弓形虫卵囊或者组织包囊污染的水或食物而被感染。弓形虫感染可以导致免疫力低下的禽类死亡，造成畜禽饲养业的经济损失[1]。目前弓形虫的检测包括血清学试验、病理形态学检验、大鼠腹腔接种以及核酸检测等方法，其中血清学试验的阳性率较高但是常伴随假阳性[2]。使用PCR技术检测弓形虫核酸具有快速并且敏感性和特异性高等优点[3]，采用PCR技术分析人类、猫和家畜中弓形虫感染状况在国内外均有应用[4]。李永年[5]和王大伟[6]分别检测了贵州省和辽宁省猪中弓形虫感染情况，同时发现弓形虫感染在家禽中也存在。但是通过PCR检测河南省鸭、鹅和鸽弓形虫感染状况尚无报导。从2015年2月到9月，我们采集血液样品并使用巢式PCR对河南省家禽弓形虫感染状况进行了流行病学调查如下。
2 材料和方法
2.1 试剂 蛋白酶K购自德国Merck生物科技公司，Tris饱和酚和PCR扩增试剂购自北京康为世纪生物公司，弓形虫RH株保存在新乡医学院寄生虫学教研室，其余试剂均购自国内。
2.2 样品采集和处理 2015年2月至9月期间，随机从郑州、周口、新乡和开封的农贸市场、家禽饲养场和公园采集1152份血液样品。所有样品均置于?80 °C超低温冰箱保存。
2.3 提取样品DNA 使用酚试剂提取样品DNA和弓形虫RH株。
2.4 巢式PCR扩增 家禽血样中基因组DNA作为模板，采用单管一步法巢式PCR对弓形虫529重复片段进行扩增。外套引物序列为：F：5'-CGC TGC AGG GAG GAA GAC GAA AGTTG-3'，R：5'-CGC TGC AGA CAC AGT GCA TCT GGA TT-3'；内套引物序列为：F：5'-AGA AGG GAC AGA AGT CGA AG-3'，R：5'-CTC CAC TCT TCA ATT CTC TCC-3'。引物由上海生工生物科技公司合成，PCR反应条件为：95℃2min； 95℃30s，68℃30s，72℃50s； 95℃30s，58℃30s，72℃50s，72℃5min，共35个循环，用10 μl扩增产物进行核酸凝胶电泳分析。采用弓形虫RH株速殖子DNA作为阳性对照，正常血样DNA作为阴性对照，ddH2O作为空白对照。
2.5 统计分析 所有数据均通过SPSS19.0统计软件进行分析，使用检验比较不同家禽间血样中弓形虫感染的阳性率，P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 弓形虫529多拷贝片段扩增结果 经过琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增的目标条带是弓形虫529片段，RH株弓形虫在260bp处可见目的条带，阴性对照和空白对照均未显示目标条带。具体见图1。
图1 弓形虫529多拷贝片段扩增结果
M： DNA marker； A：正常大鼠 DNA； B： RH阳性； 98–120：鸡样品DNA； 121：空白对照.
3.2 河南不同家禽中弓形虫感染阳性率 在鸡、鸭、鹅和鸽总计1152份样本中，175份检测出弓形虫阳性，阳性率15.19%，不同种类家禽感染率不同(=25.68)，差异性显著(P<0.05)。鹅的弓形虫阳性率最高(24.31%)，鸽的弓形虫阳性率最低(5.39%)。
3.3 不同饲养方法的家禽中弓形虫感染阳性率
3.3.1 不同条件下各种家禽中弓形虫感染阳性率 和其它家禽相比，鹅的弓形虫阳性率很高，其中散养鹅的阳性率最高(25.00%)，其次为散养鸡；鸽的感染率较低，其中信鸽的阳性率最低(3.61%)。组间差异显著(P<0.05)，分析显示散养鸡和笼养鸡以及蛋鸭和肉鸭之间感染率差别具有统计学意义(χ?=12.65，χ?=11.22)
3.3.2 散养和笼养下蛋禽和肉禽中弓形虫感染的阳性率 散养和笼养组间以及蛋禽和肉禽组间弓形虫感染的阳性率差异性显著(χ?=7.58，χ?= 34.81，P<0.05)，蛋禽弓形虫感染率高于肉禽，散养高于笼养。散养蛋禽和笼养蛋禽以及散养肉禽和笼养肉禽之间弓形虫感染阳性率也有差异(χ?=14.71，χ?=16.10，P<0.05)，散养蛋禽和散养肉禽的阳性率分别均高于笼养蛋禽和笼养肉禽。
3.3.3 不同地区中家禽弓形虫感染的阳性率 阳性率最高的是周口地区的鹅(30.56%)，最低是周口地区的鸽(1.69%)，不同地区中家禽弓形虫感染阳性率不同。
4 讨论
弓形虫是一种专性细胞内寄生的机会性致病性原虫，可寄生于鱼类、鸟类、爬行动物和哺乳动物引起无特异性的各种临床表现，其裂殖子和速殖子包囊均有感染性。感染后可引起周围动物感染导致疾病甚至引起死亡。文献表明[7]PCR技术比其它方法更适合弓形虫感染的流行病学调查。本研究结果提示河南省家禽中弓形虫感染比较常见，不同家禽中弓形虫的感染状况不同，阳性率差异有统计学意义。家禽中鹅感染率最高，鸽感染率最低。原因可能是鹅的生长繁殖周期长而感染的概率增加；而鸽常为笼养接触传染源的概率低。结果还提示家禽弓形虫感染率和饲养方式有关，散养家禽感染率明显高于笼养家禽。室外散养鸡容易接触到散布在饲料、水和土壤中的弓形虫卵囊，因此散养鸡感染率也可以被作为是土壤被弓形虫卵囊污染的指标[8]。相反笼养家禽的生长环境封闭，卫生和管理条件较好，切断了弓形虫的传播途径而感染率较低。
本研究显示不同城市中弓形虫感染阳性率的差异是显著的，提示家禽饲养过程中应预防寄生虫感染。食用半熟的鸡肉和鸭肉增加了人类弓形虫感染率[9]。因此在食用肉类前应彻底加热以减少弓形虫感染。由于卵囊的抵抗力较强[10]，店主应应定期消毒禽舍并對传染源采取预防措施，如减少老鼠、苍蝇、蟑螂和蚯蚓[11]。如今公共食品卫生安全广受重视，家禽的弓形虫感染问题也应引起关注。 (赵林静 张振超 刘世国 张露文 王帅)
1 前言
刚地弓形虫可以感染人类和鸟类等动物，是常见寄生虫。人或动物通过摄入被弓形虫卵囊或者组织包囊污染的水或食物而被感染。弓形虫感染可以导致免疫力低下的禽类死亡，造成畜禽饲养业的经济损失[1]。目前弓形虫的检测包括血清学试验、病理形态学检验、大鼠腹腔接种以及核酸检测等方法，其中血清学试验的阳性率较高但是常伴随假阳性[2]。使用PCR技术检测弓形虫核酸具有快速并且敏感性和特异性高等优点[3]，采用PCR技术分析人类、猫和家畜中弓形虫感染状况在国内外均有应用[4]。李永年[5]和王大伟[6]分别检测了贵州省和辽宁省猪中弓形虫感染情况，同时发现弓形虫感染在家禽中也存在。但是通过PCR检测河南省鸭、鹅和鸽弓形虫感染状况尚无报导。从2015年2月到9月，我们采集血液样品并使用巢式PCR对河南省家禽弓形虫感染状况进行了流行病学调查如下。
2 材料和方法
2.1 试剂 蛋白酶K购自德国Merck生物科技公司，Tris饱和酚和PCR扩增试剂购自北京康为世纪生物公司，弓形虫RH株保存在新乡医学院寄生虫学教研室，其余试剂均购自国内。
2.2 样品采集和处理 2015年2月至9月期间，随机从郑州、周口、新乡和开封的农贸市场、家禽饲养场和公园采集1152份血液样品。所有样品均置于?80 °C超低温冰箱保存。
2.3 提取样品DNA 使用酚试剂提取样品DNA和弓形虫RH株。
2.4 巢式PCR扩增 家禽血样中基因组DNA作为模板，采用单管一步法巢式PCR对弓形虫529重复片段进行扩增。外套引物序列为：F：5'-CGC TGC AGG GAG GAA GAC GAA AGTTG-3'，R：5'-CGC TGC AGA CAC AGT GCA TCT GGA TT-3'；内套引物序列为：F：5'-AGA AGG GAC AGA AGT CGA AG-3'，R：5'-CTC CAC TCT TCA ATT CTC TCC-3'。引物由上海生工生物科技公司合成，PCR反应条件为：95℃2min； 95℃30s，68℃30s，72℃50s； 95℃30s，58℃30s，72℃50s，72℃5min，共35个循环，用10 μl扩增产物进行核酸凝胶电泳分析。采用弓形虫RH株速殖子DNA作为阳性对照，正常血样DNA作为阴性对照，ddH2O作为空白对照。
2.5 统计分析 所有数据均通过SPSS19.0统计软件进行分析，使用检验比较不同家禽间血样中弓形虫感染的阳性率，P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 弓形虫529多拷贝片段扩增结果 经过琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增的目标条带是弓形虫529片段，RH株弓形虫在260bp处可见目的条带，阴性对照和空白对照均未显示目标条带。具体见图1。
图1 弓形虫529多拷贝片段扩增结果
M： DNA marker； A：正常大鼠 DNA； B： RH阳性； 98–120：鸡样品DNA； 121：空白对照.
3.2 河南不同家禽中弓形虫感染阳性率 在鸡、鸭、鹅和鸽总计1152份样本中，175份检测出弓形虫阳性，阳性率15.19%，不同种类家禽感染率不同(=25.68)，差异性显著(P<0.05)。鹅的弓形虫阳性率最高(24.31%)，鸽的弓形虫阳性率最低(5.39%)。
3.3 不同饲养方法的家禽中弓形虫感染阳性率
3.3.1 不同条件下各种家禽中弓形虫感染阳性率 和其它家禽相比，鹅的弓形虫阳性率很高，其中散养鹅的阳性率最高(25.00%)，其次为散养鸡；鸽的感染率较低，其中信鸽的阳性率最低(3.61%)。组间差异显著(P<0.05)，分析显示散养鸡和笼养鸡以及蛋鸭和肉鸭之间感染率差别具有统计学意义(χ?=12.65，χ?=11.22)
3.3.2 散养和笼养下蛋禽和肉禽中弓形虫感染的阳性率 散养和笼养组间以及蛋禽和肉禽组间弓形虫感染的阳性率差异性显著(χ?=7.58，χ?= 34.81，P<0.05)，蛋禽弓形虫感染率高于肉禽，散养高于笼养。散养蛋禽和笼养蛋禽以及散养肉禽和笼养肉禽之间弓形虫感染阳性率也有差异(χ?=14.71，χ?=16.10，P<0.05)，散养蛋禽和散养肉禽的阳性率分别均高于笼养蛋禽和笼养肉禽。
3.3.3 不同地区中家禽弓形虫感染的阳性率 阳性率最高的是周口地区的鹅(30.56%)，最低是周口地区的鸽(1.69%)，不同地区中家禽弓形虫感染阳性率不同。
4 讨论
弓形虫是一种专性细胞内寄生的机会性致病性原虫，可寄生于鱼类、鸟类、爬行动物和哺乳动物引起无特异性的各种临床表现，其裂殖子和速殖子包囊均有感染性。感染后可引起周围动物感染导致疾病甚至引起死亡。文献表明[7]PCR技术比其它方法更适合弓形虫感染的流行病学调查。本研究结果提示河南省家禽中弓形虫感染比较常见，不同家禽中弓形虫的感染状况不同，阳性率差异有统计学意义。家禽中鹅感染率最高，鸽感染率最低。原因可能是鹅的生长繁殖周期长而感染的概率增加；而鸽常为笼养接触传染源的概率低。结果还提示家禽弓形虫感染率和饲养方式有关，散养家禽感染率明显高于笼养家禽。室外散养鸡容易接触到散布在饲料、水和土壤中的弓形虫卵囊，因此散养鸡感染率也可以被作为是土壤被弓形虫卵囊污染的指标[8]。相反笼养家禽的生长环境封闭，卫生和管理条件较好，切断了弓形虫的传播途径而感染率较低。
本研究显示不同城市中弓形虫感染阳性率的差异是显著的，提示家禽饲养过程中应预防寄生虫感染。食用半熟的鸡肉和鸭肉增加了人类弓形虫感染率[9]。因此在食用肉类前应彻底加热以减少弓形虫感染。由于卵囊的抵抗力较强[10]，店主应应定期消毒禽舍并對传染源采取预防措施，如减少老鼠、苍蝇、蟑螂和蚯蚓[11]。如今公共食品卫生安全广受重视，家禽的弓形虫感染问题也应引起关注。 (赵林静 张振超 刘世国 张露文 王帅)