抗菌肽在牙周先天免疫防御中作用的研究进展
摘要 牙周病是牙齿表面和牙龈组织中的混合菌斑引发的一种炎症性疾病。菌斑中的细菌及其毒性产物扰乱牙龈上皮细胞的防御机制而使牙龈组织的损伤，附着丧失以及牙周袋的产生甚至可导致牙槽骨的丧失，牙齿的脱落最终导致牙周病的产生。抗菌肽在抑制牙周致病菌方面具有重要作用，文章就抗菌肽与牙周病的关系及几种重要的抗菌肽在牙周病中的重要作用作一综述。
关键词 牙周病；牙周致病菌；抗菌肽；先天免疫发应
人体口腔中含有700多种细菌，但是只有8种口腔细菌与牙周病密切相关，包括牙龈卟啉单胞菌，福赛坦纳菌，齿垢密螺旋体，具核梭杆菌，变黑普氏菌，中间普氏菌，伴放线放线杆菌，侵蚀艾肯菌[1]。研究发现在正常的的牙周组织和牙周疾病的组织内都有这些细菌的存在，只是在牙周病变的组织中，这些细菌的数量明显增多[2]。牙周炎破坏性严重程度是由炎症反应决定的而非细菌的感染引起，宿主对细菌生物膜及其毒素的反应是牙周炎发展的过程中的重要因素[3]。宿主的免疫反应包括先天性和获得性免疫反应，其中先天免疫反应是由唾液腺，口腔上皮细胞和嗜中性粒细胞分泌的抗菌蛋白和抗菌肽(AMPS)组成[3]。
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1 抗菌肽与口腔细菌
目前已发现唾液中含有超过45个的抗菌蛋白质和抗菌肽的混合物。其中已知的AMPS可分成六大家族：1阳离子肽，2细菌凝集和粘附素，3金属离子螯合剂，4过氧化物酶，5蛋白酶抑制剂，6对抗细菌细胞壁的AMPS [4]。这些抗菌肽组成口腔先天免疫系统的重要屏障有效的对抗口腔内各种细菌。当遇到口腔内拔牙，口腔外科手术或其他口腔粘膜急性损伤时很少导致感染或炎症的损伤。这可能是由于被招募到损伤部位的嗜中性粒细胞提供了必要的抗菌肽，防止细菌定植。
2 口腔中AMPs的表达
AMPs存在于唾液和龈沟液中[4],但是只有一小部分的AMPs在唾液和龈沟液中的浓度高于口腔最低的抑菌浓度,包括弹性蛋白酶抑制剂以及人类防御素-1(HNP-1)[4]。由于牙周病的局部性质，唾液中AMPs的浓度被显著稀释，而这可能并不与其在牙周袋中发现的浓度直接相关。因此我们推测，分泌AMPs的口腔上皮细胞或嗜中性粒细胞的局部可能具有更高的浓度，尤其是募集中性粒细胞的损伤部位，会还有更高的富含抗菌肽的混合物，尽管AMPs能够抵抗浮游的口腔细菌，但当其抵抗口腔菌斑生物膜时这些浓度有可能是不足够的，因而当中性粒细胞无法抵抗菌斑生物膜中的细菌时便会产生“吞噬失意”进而在牙周袋中释放酶物质和氧化产物而造成牙周组织的损伤[3]。口腔唾液中含有45种AMPs，当牙周病组织中有13种抗菌肽上调而11种发生下调，如防御素和抗菌肽(LL-37)是口腔黏膜中重要的抗菌物质，然而当牙龈上皮细胞感受到细菌的刺激时只有LL-37在外周血中的中性粒细胞得以表达。目前尚不清楚的是，AMPs表达的调控是由于细菌的刺激或是靶细胞刺激的功能性反应。因此，抗菌肽的生物活动可能在牙龈炎症中发挥重要作用。
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3 抗菌肽和抗菌蛋白的生物学作用
AMPs的多种生物活性在对口腔细菌及其毒素的天然免疫防御中发挥作用。除了直接的抗菌活性如杀菌活性，释放细菌凝集素，抗菌肽还可通过灭活细菌或者结合脂多糖(LPS)等细菌毒素影响牙周病的进展过程。一些AMPs还会影响粘膜组织的炎症反应，伤口的愈合，并且可以成为免疫系统的调节剂[5]。以下我们将对LL-37，防御素和分泌性白细胞蛋白酶抑制剂的生物活性进行阐述。
3.1 LL-37
LL-37是来自人抗菌肽通过蛋白水解加工而成的含有37个氨基酸的多功能肽。在水溶液中该多功能肽呈无规卷曲状态，而当暴露在脂质膜上则呈现α-螺旋构象。它能够抑制革兰氏阳性菌和阴性菌，还可通过介导宿主细胞分泌 IL-2，IL-12而激活巨噬细胞和自然杀伤细胞从而吞噬或杀伤病原菌[6]。在生理条件下通过研究可知，生理缓冲液中在碳酸盐存在的情况下，LL-37的活性的抑制作用明显减轻，因此在碳酸盐存在的情况下，当靶细菌修饰其细胞壁时将会增强LL-37的易感性并使LL-37分泌增加[7]。高浓度的LL-37用于抗菌并和其他抗菌肽一样其可作为免疫系统“警报器”，即内源性介体募集并激活抗原呈递细胞以增强先天免疫和适应性免疫应答[8]。综上，LL-37是一种可影响牙周疾病的细菌定植，细菌毒性和宿主反应发展的多功能肽。
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3.2 防御素
防御素家族是口腔上皮细胞和中性粒细胞中一种重要的AMPs，人β-防御素(HBD)主要表达于上皮细胞，而α-防御素(人中性粒细胞肽; HNP),主要表达于中性粒细胞，HNP广泛存在于结合上皮, 对龈沟内微生物发挥抗菌活性, 保护结合上皮。在慢性牙周炎患者龈沟液中，HNP1-3的分泌水平可上调60倍，在侵袭性牙周炎中上调15倍 [9]。防御素可同时与LL-37发挥其生物活性作用。防御素储在高浓度的分泌颗粒中，可融合含有吞噬空泡的分泌颗粒以杀灭吞噬的细菌。LL-37其抗菌效果具有盐敏感性，并具有促进其他生物活性物质分泌防御素的功能。因此防御素也是一种“警报器”，能够发挥趋化作用和激活抗原呈递细胞的作用。防御素在宿主细胞中可激发LPS的炎症反应，在牙龈上皮细胞中HBD和HNPs在中间普氏菌脂多糖的刺激下，活化细胞表面的受体以产生防御素，促进IL-1β, IL-8和细胞间粘附分子的表达[10]，共同维护口腔健康。
防御素除了在口腔感染和炎症反应中的重要作用，有研究发现，犬β-防御素基因CBD103还具有一个不寻常的作用，CBD103和黑皮素1受体的相互作用可决定犬的黑皮毛色[11]。
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3.3 白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)
SLPI是一种非糖基化的丝氨酸蛋白酶抑制剂，在嗜中性粒细胞，上皮细胞和唾液腺得以表达，抑制参与炎症组织破坏丝氨酸蛋白酶，包括嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，组织蛋白酶G等。SLPI与创伤修复有关，在创伤的情况下表达增加 通过抑制凝胶收缩，促进创口愈合，减少瘢痕形成。研究发现，SLPI缺陷的小鼠的皮肤伤口愈合困难，其弹性蛋白酶活性也较正常鼠低[12]。因此SLPI在炎症反应中具有重要作用。
4 抗菌肽和抗菌蛋白作为牙周疾病的生物标记物
唾液和龈沟内的液体对于口腔和全身系统性疾病就有重要的诊断价值[13]，基于牙周病对抗菌肽的调节，由于口腔内细菌或细菌毒素刺激而产生的蛋白质，是牙周病的一个非常有意义的标记物。上面已提到口腔唾液和龈沟液中含有45种AMPs，在牙周病时有13中AMPs发生上调，11种下调，因此我们推测AMPs是唾液样本中牙周病诊断的重要指标，利用患者上调和下调的蛋白质的比率可以克服个体间差异的影响并能够确定给定样本是否健康与否。
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综上所述，目前口腔内大量抗菌肽已经确定，其中几种受牙周致病菌的调控和表现出抗菌活性。然而，这些蛋白质在唾液浓度往往低于体外的有效浓度。因此，抗菌肽是在细胞内或从嗜中性粒细胞和上皮细胞分泌到相应部位以发挥作用，作为“报警器”，抗炎蛋白和信号分子对炎症进行分析并发挥伤口愈合作用。因此，唾液和龈沟液中的AMPs差动调节是牙周病的重要的生物标志物。
参考文献
[1]Socransky SS， Haffajee AD. Periodontal Infections[A]. In:Lindhe J， Karring T，Lang NP， editors .Clinical periodontology and implant dentistry. Oxford: Blackwell Munksgaard[J]，2008：207-67
[2] Lovegrove JM. Dental plaque revisited: Bacteria associated with periodontal disease. J N Z SocPeriodontol. 2004:7–21.
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[3]Goor S . Antimicrobial peptides in periodontal innate defense[J]Front Oral Biol.2012,15:84-98.
[4] Gorr S. Antimicrobial peptides of the oral cavity. Periodontology. 2009; 51:152–180.
[5]Soehnlein O. Direct and alternative antimicrobial mechanisms of neutrophil-derived granuleproteins. Journal of Molecular Medicine. 2009; 87:1157–1164
[6]苏瑞英，陈珊珊，赵蕾.LL-37抗菌肽及其与牙周病的关系.[J]国际口腔医学杂志,2012,3:324-327., http://www.100md.com(马珊珊 宫海环 孙鑫 王珂 马遥)
关键词 牙周病；牙周致病菌；抗菌肽；先天免疫发应
人体口腔中含有700多种细菌，但是只有8种口腔细菌与牙周病密切相关，包括牙龈卟啉单胞菌，福赛坦纳菌，齿垢密螺旋体，具核梭杆菌，变黑普氏菌，中间普氏菌，伴放线放线杆菌，侵蚀艾肯菌[1]。研究发现在正常的的牙周组织和牙周疾病的组织内都有这些细菌的存在，只是在牙周病变的组织中，这些细菌的数量明显增多[2]。牙周炎破坏性严重程度是由炎症反应决定的而非细菌的感染引起，宿主对细菌生物膜及其毒素的反应是牙周炎发展的过程中的重要因素[3]。宿主的免疫反应包括先天性和获得性免疫反应，其中先天免疫反应是由唾液腺，口腔上皮细胞和嗜中性粒细胞分泌的抗菌蛋白和抗菌肽(AMPS)组成[3]。
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1 抗菌肽与口腔细菌
目前已发现唾液中含有超过45个的抗菌蛋白质和抗菌肽的混合物。其中已知的AMPS可分成六大家族：1阳离子肽，2细菌凝集和粘附素，3金属离子螯合剂，4过氧化物酶，5蛋白酶抑制剂，6对抗细菌细胞壁的AMPS [4]。这些抗菌肽组成口腔先天免疫系统的重要屏障有效的对抗口腔内各种细菌。当遇到口腔内拔牙，口腔外科手术或其他口腔粘膜急性损伤时很少导致感染或炎症的损伤。这可能是由于被招募到损伤部位的嗜中性粒细胞提供了必要的抗菌肽，防止细菌定植。
2 口腔中AMPs的表达
AMPs存在于唾液和龈沟液中[4],但是只有一小部分的AMPs在唾液和龈沟液中的浓度高于口腔最低的抑菌浓度,包括弹性蛋白酶抑制剂以及人类防御素-1(HNP-1)[4]。由于牙周病的局部性质，唾液中AMPs的浓度被显著稀释，而这可能并不与其在牙周袋中发现的浓度直接相关。因此我们推测，分泌AMPs的口腔上皮细胞或嗜中性粒细胞的局部可能具有更高的浓度，尤其是募集中性粒细胞的损伤部位，会还有更高的富含抗菌肽的混合物，尽管AMPs能够抵抗浮游的口腔细菌，但当其抵抗口腔菌斑生物膜时这些浓度有可能是不足够的，因而当中性粒细胞无法抵抗菌斑生物膜中的细菌时便会产生“吞噬失意”进而在牙周袋中释放酶物质和氧化产物而造成牙周组织的损伤[3]。口腔唾液中含有45种AMPs，当牙周病组织中有13种抗菌肽上调而11种发生下调，如防御素和抗菌肽(LL-37)是口腔黏膜中重要的抗菌物质，然而当牙龈上皮细胞感受到细菌的刺激时只有LL-37在外周血中的中性粒细胞得以表达。目前尚不清楚的是，AMPs表达的调控是由于细菌的刺激或是靶细胞刺激的功能性反应。因此，抗菌肽的生物活动可能在牙龈炎症中发挥重要作用。
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3 抗菌肽和抗菌蛋白的生物学作用
AMPs的多种生物活性在对口腔细菌及其毒素的天然免疫防御中发挥作用。除了直接的抗菌活性如杀菌活性，释放细菌凝集素，抗菌肽还可通过灭活细菌或者结合脂多糖(LPS)等细菌毒素影响牙周病的进展过程。一些AMPs还会影响粘膜组织的炎症反应，伤口的愈合，并且可以成为免疫系统的调节剂[5]。以下我们将对LL-37，防御素和分泌性白细胞蛋白酶抑制剂的生物活性进行阐述。
3.1 LL-37
LL-37是来自人抗菌肽通过蛋白水解加工而成的含有37个氨基酸的多功能肽。在水溶液中该多功能肽呈无规卷曲状态，而当暴露在脂质膜上则呈现α-螺旋构象。它能够抑制革兰氏阳性菌和阴性菌，还可通过介导宿主细胞分泌 IL-2，IL-12而激活巨噬细胞和自然杀伤细胞从而吞噬或杀伤病原菌[6]。在生理条件下通过研究可知，生理缓冲液中在碳酸盐存在的情况下，LL-37的活性的抑制作用明显减轻，因此在碳酸盐存在的情况下，当靶细菌修饰其细胞壁时将会增强LL-37的易感性并使LL-37分泌增加[7]。高浓度的LL-37用于抗菌并和其他抗菌肽一样其可作为免疫系统“警报器”，即内源性介体募集并激活抗原呈递细胞以增强先天免疫和适应性免疫应答[8]。综上，LL-37是一种可影响牙周疾病的细菌定植，细菌毒性和宿主反应发展的多功能肽。
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3.2 防御素
防御素家族是口腔上皮细胞和中性粒细胞中一种重要的AMPs，人β-防御素(HBD)主要表达于上皮细胞，而α-防御素(人中性粒细胞肽; HNP),主要表达于中性粒细胞，HNP广泛存在于结合上皮, 对龈沟内微生物发挥抗菌活性, 保护结合上皮。在慢性牙周炎患者龈沟液中，HNP1-3的分泌水平可上调60倍，在侵袭性牙周炎中上调15倍 [9]。防御素可同时与LL-37发挥其生物活性作用。防御素储在高浓度的分泌颗粒中，可融合含有吞噬空泡的分泌颗粒以杀灭吞噬的细菌。LL-37其抗菌效果具有盐敏感性，并具有促进其他生物活性物质分泌防御素的功能。因此防御素也是一种“警报器”，能够发挥趋化作用和激活抗原呈递细胞的作用。防御素在宿主细胞中可激发LPS的炎症反应，在牙龈上皮细胞中HBD和HNPs在中间普氏菌脂多糖的刺激下，活化细胞表面的受体以产生防御素，促进IL-1β, IL-8和细胞间粘附分子的表达[10]，共同维护口腔健康。
防御素除了在口腔感染和炎症反应中的重要作用，有研究发现，犬β-防御素基因CBD103还具有一个不寻常的作用，CBD103和黑皮素1受体的相互作用可决定犬的黑皮毛色[11]。
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3.3 白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)
SLPI是一种非糖基化的丝氨酸蛋白酶抑制剂，在嗜中性粒细胞，上皮细胞和唾液腺得以表达，抑制参与炎症组织破坏丝氨酸蛋白酶，包括嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，组织蛋白酶G等。SLPI与创伤修复有关，在创伤的情况下表达增加 通过抑制凝胶收缩，促进创口愈合，减少瘢痕形成。研究发现，SLPI缺陷的小鼠的皮肤伤口愈合困难，其弹性蛋白酶活性也较正常鼠低[12]。因此SLPI在炎症反应中具有重要作用。
4 抗菌肽和抗菌蛋白作为牙周疾病的生物标记物
唾液和龈沟内的液体对于口腔和全身系统性疾病就有重要的诊断价值[13]，基于牙周病对抗菌肽的调节，由于口腔内细菌或细菌毒素刺激而产生的蛋白质，是牙周病的一个非常有意义的标记物。上面已提到口腔唾液和龈沟液中含有45种AMPs，在牙周病时有13中AMPs发生上调，11种下调，因此我们推测AMPs是唾液样本中牙周病诊断的重要指标，利用患者上调和下调的蛋白质的比率可以克服个体间差异的影响并能够确定给定样本是否健康与否。
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综上所述，目前口腔内大量抗菌肽已经确定，其中几种受牙周致病菌的调控和表现出抗菌活性。然而，这些蛋白质在唾液浓度往往低于体外的有效浓度。因此，抗菌肽是在细胞内或从嗜中性粒细胞和上皮细胞分泌到相应部位以发挥作用，作为“报警器”，抗炎蛋白和信号分子对炎症进行分析并发挥伤口愈合作用。因此，唾液和龈沟液中的AMPs差动调节是牙周病的重要的生物标志物。
参考文献
[1]Socransky SS， Haffajee AD. Periodontal Infections[A]. In:Lindhe J， Karring T，Lang NP， editors .Clinical periodontology and implant dentistry. Oxford: Blackwell Munksgaard[J]，2008：207-67
[2] Lovegrove JM. Dental plaque revisited: Bacteria associated with periodontal disease. J N Z SocPeriodontol. 2004:7–21.
, http://www.100md.com
[3]Goor S . Antimicrobial peptides in periodontal innate defense[J]Front Oral Biol.2012,15:84-98.
[4] Gorr S. Antimicrobial peptides of the oral cavity. Periodontology. 2009; 51:152–180.
[5]Soehnlein O. Direct and alternative antimicrobial mechanisms of neutrophil-derived granuleproteins. Journal of Molecular Medicine. 2009; 87:1157–1164
[6]苏瑞英，陈珊珊，赵蕾.LL-37抗菌肽及其与牙周病的关系.[J]国际口腔医学杂志,2012,3:324-327., http://www.100md.com(马珊珊 宫海环 孙鑫 王珂 马遥)