徐玲娟，盛秀胜

    核苷类似物(NA)抗HBV在临床上已得到广泛应用，但相应的HBV耐药问题也逐渐浮现出来，并成为制约其抗病毒疗效的首要因素[1-2]。由于HBV的逆转录酶没有校对功能，NA相关的HBV耐药变异多发生在多聚酶基因(P)的逆转录酶区(RT)。为此，本研究分析长期核苷(酸)类药治疗慢性乙型肝炎患者HBV逆转录酶区基因变异情况，为临床合理用药及进一步开展耐药机制研究奠定基础。

    1 材料和方法

    1.1 病例及标本来源 收集2006年1月-2010年3月在金华市中医院就诊的长期核苷(酸)类药物治疗的慢性乙型肝炎患者血清标本163份，男性标本125份，女性标本38份，患者年龄18～73岁，平均(42±12)岁。其中单用拉米夫定(1amivudine，LAM)66例，阿德福韦酯(adefovir dipivoxil，ADV)62例，患者口服拉米夫定(0.1 g/d)疗程12～36个月，阿德福韦酯(10 mg/d)疗程24～48个月。LAM和ADV序贯治疗19例，LAM与ADV联合治疗16例，疗程12～36个月。序贯治疗或联合治疗均在患者接受单剂LAM治疗后出现血清HBV DNA反跳至104拷贝/mL以上及(或)生化指标明显改变时使用。所有标本-70 ℃保存备用。

    1.2 HBV聚合酶逆转录酶区基因全序列分析 采用QIAamp DNA试剂盒(购自德国Qiagen公司)从血清中提取HBV DNA。用刘宝明等[3]报道的半巢式PCR扩增HBV全长RT区，将PCR产物直接送生工生物工程(上海)有限公司测序。用DNAStar5.0、Vector NTI 13.0等软件分析HBV RT区核苷酸及氨基酸序列，并分别将其与先前报道的突变序列相应位点上的氨基酸比对，筛查分析RT区6个主要的耐药变异位点rtl73、rtl80、rtl81、rt204、rt207和rt236氨基酸耐药变异[4]。

    1.3 HBV基因型检测 由于HBV RT区与编码HBsAg的S基因区相互重叠，其核苷酸序列也可决定HBV基因型。为此本研究在RT区基因分析基础上，应用NCBI病毒基因分型工具及MEGA4.0软件对HBV的S基因区核苷酸序列进行系统进化分析 ......