戴晓春，黄晓燕，周希，高瞻，王本极，张艳丽，杨德业

    (温州医学院附属第一医院 心内科，温州医学院心血管生物和基因研究所，浙江 温州 325000)

    室间隔缺损(ventricular septum defect，VSD)是常见的先天性心脏病，杨德业教授的研究组已证实Pax-8与下游基因NR4A1是和VSD生长发育相关的基因，Pax-8基因被系统敲除后，显示左心室肌和室间隔心肌细胞凋亡程度严重，同时伴有线粒体体积减少，数量增多[1-2]。大多数的研究显示，线粒体在凋亡信号转导过程中起了重要作用，特别是线粒体内膜上的解偶联蛋白 2(uncoupling protein 2，UCP2)。UCP2具有质子的转运活性，引起线粒体质子漏，使氧化磷酸化解偶联，调控线粒体合成ATP，抑制线粒体内活性氧族(ROS)[3]。ROS参与了凋亡信号转导通路的不同阶段[4]。上述研究提示UCP2是一个重要的凋亡调节基因。本实验观察Pax-8基因抑制后心肌细胞中UCP2的变化，探讨UCP2在心肌细胞凋亡中的作用。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 动物：Pax-8基因敲除的纯合子小鼠(Pax-8 KO-/-)、Pax-8基因敲除的杂合子小鼠(Pax-8 KO+/-)和野生型小鼠(Pax-8 KO+/+)各10只。(Pax-8 KO+/-)小鼠由德国Peter Gruss和Ahmed Mansouri教授惠赠。

    1.1.2 细胞：H9C2(2-1)大鼠胚胎心肌细胞株购自中科院上海细胞库，置于含10%胎牛血清DMEM培养基中，在37 ℃，5% CO2孵箱中培养。

    1.1.3 试剂：Lipofectamine 2000转染试剂盒1、Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，小鼠抗大鼠Pax-8抗体、小鼠抗大鼠UCP2抗体、兔抗小鼠IgG抗体购自英国Abcam公司，小鼠抗GAPDH抗体购自上海康成生物工程有限公司，ECL化学发光显色试剂盒购自美国Cell Signal 公司，RT试剂盒购自加拿大MBI Fermentas公司，PCR试剂盒购自美国Promega公司，PMSF RIPA BCA蛋白浓度测定试剂盒购自江苏海门碧云天试剂公司，线粒体提取试剂盒购自美国Pierce公司，其他试剂均为进口或国产分析纯。

    1.2 方法

    1.2.1 PCR鉴定小鼠基因型：剪取小鼠尾尖0.5～1 cm，消化小鼠尾巴，提取DNA，进行PCR扩增反应。引物为5’-GGATGTGGAATGTGTGCGAGG-3’ ......