重组人EGF-IL-18融合蛋白直接竞争ELISA方法的建立
食蟹,包被,精密度,1材料和方法,2结果,3讨论
洪德芳,艾冬冬,丁麟超,吕建新,钟连进,厉保秋,高丽昌,金丽琴(1.温州医科大学 检验医学院、生命科学学院,浙江 温州 325035;2.山东弘立医学动物实验研究有限公司,山东 济南 250101)
白细胞介素(IL)-18是一种炎症和免疫增强因子,刺激Th1细胞和NK细胞分泌干扰素γ(IFN-γ),明显增强Th1免疫反应,具有良好的抑制肿瘤作用[1-2]。然而由于IL-18的效应细胞广泛分布于人体全身,易引起全身的炎症反应。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在许多恶性肿瘤细胞表面均过度表达,对一些恶性肿瘤细胞的细胞周期、增殖及侵袭等方面起关键作用[3-5]。有研究表明,EGFR配体的第三个环状结构保守基序(C-loop)可特异性与肿瘤细胞表面的EGFR结合但并无活化EGFR的功能[6]。因此,彭颖等[7-9]通过融合EGF受体干扰基序和IL-18成熟肽分子,构建了一种能靶向结合肿瘤细胞的rhEGF-IL-18融合蛋白,并将其在毕赤酵母系统中进行表达。
为了进行rhEGF-IL-18融合蛋白在动物体内的药代动力学研究,为后续的临床试验打下基础,需要建立一种可靠的血药浓度检测方法。为此,本研究选择了比较具有代表性的食蟹猴进行给药,针对蛋白类药物的特点建立了检测给药食蟹猴血清中rhEGF-IL-18融合蛋白浓度的直接竞争ELISA方法,并对其进行了方法学评价。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 药品及抗体:rhEGF-IL-18标准品(1 000 μg/mL)由温州医科大学提供;抗rhEGF-IL-18抗体血清由山东弘立医学动物实验研究有限公司提供;抗rhEGF-IL-18抗体和酶标抗原委托北京博奥森生物技术有限公司纯化制备。
1.1.2 主要仪器及试剂:多功能酶标仪(OLYMPUS);96孔可拆酶标板(CORNING);高速低温离心机(BeckMan);食蟹猴空白血清(山东弘立医学动物实验研究有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 ELISA操作流程:①包被:将稀释到工作浓度的抗rhEGF-IL-18抗体加入到ELISA板条中,每孔100μL,4 ℃中包被过夜。②封闭:每孔加入200μL的封闭液(0.01 mol PBS 15倍稀释1.5%干酪素),37 ℃ 2 h后甩干 ......
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