卢晓声，陈菁，赵军招，吕杰强

    (1.温州医科大学附属第二医院 生殖中心，浙江 温州 325027；2.温州医科大学 第二临床医学院，浙江 温州 325035)

    人乳头状瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是一种嗜上皮病毒，可导致人类皮肤和黏膜病变[1]。尽管HPV型别众多，但流行病学研究表明HPV 16感染为全球宫颈癌致病主要型别[2]。HPV早期癌蛋白E6在宫颈上皮细胞癌变过程中起着重要作用。有研究认为宫颈癌是一种激素依赖性的疾病，雌激素在HPV致癌的过程中有协同作用[3]。但是，雌激素水平的升高是否与HPV感染有关目前尚存在争议。本研究采用不同浓度的雌二醇(17-β-E2，E2)作用于单层培养的人类永生化表皮细胞系HaCat，向细胞内转染HPV 16型的主要致癌基因E6，模拟HPV感染人类上皮细胞的生物过程，探讨雌激素对宿主细胞感染HPV的影响。

    1 材料和方法

    1.1 细胞与质粒 HaCaT细胞系购于中国典型培养物保藏中心(武汉大学细胞库)，以10% FBS+1%青霉素/链霉素双抗+高糖型DMEM培养基(美国Gibco公司)，于37 ℃，5% CO2，饱和湿度条件下常规培养，隔天换液，7 d 1∶3传代；含HPV l6 E6的真核表达质粒由本实验室保存。

    1.2 主要试剂与仪器 E2购于美国Sigma公司；D6922-01质粒提取试剂盒购于美国OMEGA生物技术公司；Lipofectione 2000转染试剂盒购于美国Invitrogen公司；实时荧光定量PCR试剂盒购于美国MBI Fermentas公司；APO-BRDU?试剂盒购于美国eBioscience公司。

    1.3 方法

    1.3.1 细胞生长曲线绘制(细胞计数法)：取对数生长期的HaCat细胞制备细胞悬液，调整细胞浓度为10000个/孔接种于24孔板。细胞贴壁后，分别采用含有10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，0 mol/L的E2培养液培养，每48 h换液1次。每24 h取不同浓度的细胞制备细胞悬液。使用血细胞计数板进行细胞计数(3次/孔并取均值)，共计数7 d。

    1.3.2 细胞活性测定(MTT法)：制备细胞悬液，以2000个细胞/孔的密度接种于96孔板中。细胞贴壁后分7组，分别加入含10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，0 mol/L(对照组)的E2的培养基以及PBS液(Control)200 μL。在培养24 h、48 h、72 h三个节点 ......