张辉，孙嘉利，陈泽新，武垚森，林焱

    (1.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 骨科，浙江 温州 325027；2.温州医科大学 第二临床医学院，浙江 温州 325035)

    骨关节炎(osteoarthritis，OA)又称退行性关节炎，往往被认为是一种与多种因素相关、引起关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生的慢性退行性病变。但是OA的具体分子机制目前尚不清楚。研究[1-2]表明，OA的发生及进展与软骨细胞的衰老及软骨退变密切相关，通过抑制细胞衰老可延缓OA的发生。因此，对延缓软骨细胞衰老的研究是进一步了解OA发生的具体机制及提供预防和治疗OA的新思路的重要途径及方向之一。

    Sirt6是一种具有NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶，作为Sirtuins家族的一员，Sirt6的生物学效应涉及延缓衰老、抑制炎症、稳定基因组等功能。有研究表明Sirt6可明显抑制骨骺的发育[3]。但目前Sirt6对软骨细胞功能的影响尚不明确。本研究通过体外实验研究Sirt6与软骨细胞衰老及细胞功能退变的关系，旨在验证Sirt6对软骨细胞衰老的影响，并探讨其可能机制。

    1 材料和方法

    1.1 材料 由温州医科大学实验动物中心提供的清洁级2周龄雄性SD大鼠，动物使用许可证号：SYXK(浙)2015-0009。胰蛋白酶(美国Hyclone公司)，青链霉素(美国Gibco公司)，II型胶原酶(美国Hyclone公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，F12培养基(美国Hyclone公司)，β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)染色试剂盒(南京碧云天生物技术公司)，质粒抽提试剂盒(德国Qiagen公司)，shSirt6质粒(上海吉玛公司)，Sirt6质粒、Sirt6-GFP质粒和LC3-Cherry质粒(由浙江大学医学院刘伟教授惠赠)，兔多克隆抗体Anti-Sirt6(美国Abcam公司)，兔抗兔多克隆抗体LC-3(美国Celt Signal-ing Technology公司)，3-甲基腺嘌呤(3-methylad-enine，3-MA)(美国Sigma公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 软骨细胞培养：将分离得到的软骨切成0.3～0.5 mm组织块，含双抗PBS液冲洗3遍，加入0.25%胰蛋白酶在37 ℃消化2 h后终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入0.2% II型胶原酶在37 ℃温箱消化过夜，终止消化后200目滤网过滤，收集滤液，1 500 r/min离心5 min ......