陈千杰，张金三，郭强，董晶莱，郭丽莎，李校堃

    (温州医科大学 药学院，浙江 温州 325035)

    胰腺癌是恶性肿瘤，患者5年生存率不足5%[1]。 其增殖、侵袭能力极强，往往在发病早期即发生转移，是治疗的难点[2-4]。Yes-关联蛋白1(Yesassociate protein 1，YAP1)作为Hippo通路的关键转录辅助因子在胰腺癌的发生发展中有重要作用[5]，但相关机制仍不明了。YAP1具有调控细胞存活和增殖作用，参与癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)[6]。EMT是肿瘤转移的关键环节[7-8]。YAP1通过与转录因子结合参与胚胎发育进程[7，9-12]，在胚胎发育中起重要作用的因子，在癌变过程中往往被激活[13-14]。 当抑制KRAS后，会上调YAP1的表达，使YAP1直接参与肿瘤的形成[15-17]。本研究构建敲除YAP1基因的L3.6细胞，检测YAP1对L3.6细胞的增殖及迁移能力的影响。

    1 材料和方法

    1.1 材料 人胰腺癌细胞株L3.6购自美国模式培养物集存库；pSpCas9(BB)-2A-Puro V2载体购自美国Addgene公司；DMEM培养液、胰蛋白酶、1%青链霉素、胎牛血清购于美国Gibco公司；RNA提取试剂购于美国Invitrogen公司；EndoFectinTMMax转染试剂购自广州复能基因有限公司；考马斯亮蓝购自上海碧云天生物公司；YAP(D8H1X)XP Rabbit抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，GAPDH 单克隆抗体购自英国Abcam公司；Western blot相关试剂、羊抗小鼠IgG二抗与羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物科技有限公司；正置、倒置荧光显微镜购自日本尼康公司；PCR仪、电泳仪、电泳槽、化学发光成像仪购自美国Bio-Rad公司，BD Accuri C6流式细胞仪购自美国BD公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度计购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；酶联免疫检测仪购自美谷分子仪器(上海)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养：L3.6细胞在含有10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养基中培养，常规置于37℃、5% CO2环境下生长。细胞融合至80%左右时常规传代。

    1.2.2YAP1敲除载体的构建：采用CRISPR-Cas9技术在L3.6细胞中敲除YAP1基因。首先针对YAP1基因的第1个外显子序列 ......