吕开绩，陈旭东，程开，王路得，朱进顺，Kamara Saidu，张丽芳，朱冠保

    (1.温州医科大学附属第一医院 胃肠外科，浙江 温州 325015；2.温州医科大学 分子病毒与免疫研究所 微生物学与免疫学教研室，浙江 温州 325035)

    程序性死亡分子1(programmed death-1，PD-1)及其配体(programmed death ligand-1，PD-L1)是属于B7家族的协同刺激分子。PD-1是I型跨膜糖蛋白，由胞外区、疏水性跨膜区、细胞质区组成，CD4+T细胞、CD8+T细胞、NKT细胞、B细胞和单核细胞等在激活后都能表达PD-1分子[1]。PD-L1也属I型跨膜蛋白，同样具有胞外区、疏水性跨膜区、细胞质区，PDL-1可在IFN-γ诱导作用下广泛表达于许多肿瘤细胞表面，研究表明，在黑色素瘤、结肠癌、肺癌等肿瘤中呈现过表达[2]。当PD-1与PD-L1结合后，会启动T细胞的抑制信号转导，显著抑制T细胞活化和增殖，导致细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的凋亡，使得机体的免疫监控无法识别肿瘤细胞，从而可逃避宿主免疫，最终导致肿瘤的进一步发展[3-4]。阻断该信号转导通路后可以恢复T细胞的功能，因此PD-1/PD-L1介导的信号转导通路正成为肿瘤治疗研究的热门靶点。本研究采用原核表达系统制备了小鼠PD-1胞外区(mPD-1)及其配体PD-L1胞外区(mPD-L1)蛋白，并且用mPD-L1蛋白免疫日本大耳兔从而获得多克隆抗体，并分别应用ELISA和免疫荧光的方法，验证了原核表达的mPD-L1和mPD-1之间的结合亲和性，以及原核表达的mPD-1和天然mPD-L1之间的结合亲和性，为PD-L1过表达的肿瘤的靶向诊断及治疗研究提供基础。

    1 材料和方法

    1.1 材料 pET21a(+)、pGEX 4T-1克隆载体和E.coliBL21(DE3)为本实验室保存。DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶NedI、XhoI、EcoRI购自美国Thermo公司；异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)购自美国默克公司；氨苄青霉素购自济南齐鲁药厂；弗式佐剂购自美国Sigma公司；小鼠抗His mAb、小鼠抗GST mAb购自杭州联科生物技术有限公司；HRP标记的山羊抗兔IgG(H+L)抗体和山羊抗鼠IgG(H+L)抗体、FITC标记的羊抗兔IgG(H+L)和羊抗鼠IgG(H+L)购自上海联科生物技术公司；镍螯合亲和层析胶(Ni-NTA Agarose)购自德国Qiagen公司；B16细胞株由本实验室保存；胎牛血清购自美国Gibco公司；RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司；健康日本大耳白兔(雌性 ......