林武，黄昭帅，鲍苗，陈肖鸣

    (温州医科大学附属第一医院 小儿外科，浙江 温州 325015)

    得益于胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)的多向分化潜能，其为终末期肝脏疾病提供了可观的潜在细胞移植供体。和体外培养的人原代肝细胞相比，诱导而来的“肝细胞样细胞”的表型相对不成熟[1-6]，表现出与人体胚胎肝更相近的功能及表型特征[7]。然而即使是这样不成熟的肝细胞却也能很大程度地改善肝功能[8-9]。另外，在细胞移植中约只有10%的移植细胞存活[10-11]。近年来，ESC分泌因子的细胞保护作用逐渐被人们揭示，我们假设ESC移植治疗肝脏损伤疾病的成功不仅是细胞移植本身的组织替代作用，其分泌的细胞因子也能够帮助肝细胞抵抗凋亡，修复肝损伤。

    1 材料和方法

    1.1 材料 DMEM/F12、丙酮酸钠、非必需氨基酸、 2-巯基乙醇、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、 0.25%胰酶EDTA购于美国Gibco公司；核酸混合物、白细胞抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)购于美国Millipore公司；胰岛素转铁蛋白硒混合物(insulin-transferrin-selenium，ITS)、双抗(100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)购于美国Invitrogen公司；地塞米松、MTT试剂盒购于美国Sigma公司；CO2细胞培养箱购于美国Thermo公司；缺氧装置购于加拿大Stemcell Technologies公司；Seahorse线粒体应激检测试剂盒购于美国Agilent公司。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养：ESC(F12)细胞系由美国罗格斯大学医学院Melitta Schachner教授赠予；完全培养基为15% FBS、1%丙酮酸钠、1%非必需氨基酸、1%核酸混合物、0.2% 2-巯基乙醇、1%双抗、0.01% LIF；基础培养基为高糖DMEM(含L-谷氨酰胺)，培养ESC时需要每天加入0.01% LIF以维持ESC的未分化状态。解冻ESC，接种到用丝裂霉素处理的铺满成纤维细胞滋养层的培养皿中，在传过3～4代之后，成纤维细胞滋养层细胞基本去除干净，ESC悬浮培养于其完全培养基中。本课题中以其完全培养基为对照培养基即CON-M；ESC每2～3 d传1代，并收集上清液，此ESC上清液即为条件培养基即ESC-M。细胞于含5% CO2、37℃的细胞培养箱中培养。AML-12细胞系为一种鼠源性肝细胞系，从美国ATCC公司购入；AML-12细胞完全培养基(简写为CM)为10% FBS、1% ITS、40 ng/mL地塞米松、1%双抗、88% DMEM/F12 ......