黎运呈，曾芳，丁贤君，李世波

    (1.舟山医院 感染科，浙江 舟山 316000；2.舟山市妇幼保健院 产前诊断实验室，浙江 舟山316004)

    肝癌是成人肝脏最常见的原发性恶性肿瘤，也是全世界最常见的恶性程度最高的实体瘤之一，其病死率位列第三[1-2]。在同一类型的肿瘤中，癌干细胞(cancer stem cells，CSCs)仍然具有异质性且可能存在不同侵袭转移能力的CSCs亚群。有学者推断肝癌是肝癌干细胞(liver cancer stem cells，LCSCs)增殖和分化形成的肿瘤器官，LCSCs的残存是肝癌复发的根源，且至少部分肝转移癌的形成应当由LCSCs来完成[3]。有研究者认为LCSCs是肝癌组织侵袭、转移的基础和源头[4]。本研究拟在前期研究[5]基础上，以高迁移肝癌细胞系(HCCLM3)为研究对象，建立高侵袭性肝癌干细胞(high-invasion liver cancer stem cells，H-ILCSCs)和低侵袭性肝癌干细胞(low-invasion liver cancer stem cells，L-ILCSCs)模型并进行生物学鉴定，为肝癌侵袭和转移的研究探索新的方向。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要试剂：NOD-SCID免疫缺陷鼠(6～8周龄)购自中国科学院上海实验动物中心(动物合格证号：20150005)。Mat-rigel胶和流式抗体购自美国BD公司。Transwell小室购自美国Corning公司。CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司。CD133、CD44、CD90磁珠购自德国Miltenyi公司。B27购自美国Gibco公司，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)购自美国PeproTech公司。

    1.1.2 细胞培养：人高迁移肝癌细胞系HCCLM3、正常肝细胞HL-7702购自上海中国科学院典型培养物保藏中心，其中HL-7702细胞是第6代。肝癌细胞HCCLM3培养：DMEM培养基加10%胎牛血清；HL-7702培养：RPMI-1640培养基加10%胎牛血清；H-ILCSCs和L-ILCSCs培养：DMEM培养基98%，B27生长因子2%，再加入EGF/bFGF，使其终浓度为20 ng/mL。所有细胞均在37 ℃，5% CO2培养箱条件下培养。

    1.2 方法

    1.2.1 Transwell侵袭实验分离高、低侵袭性HCCLM3细胞：参照TIE等[6]的操作方法 ......