李军建，陈钢，朱千东，余正平

    (温州医科大学附属第一医院 肝胆外科，浙江 温州 325015)

    胰腺癌的恶性程度高，现有治疗手段未能有突破性进展[1-3]。研究发现，微小RNA(miRNA)在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，如白血病、乳腺癌、肝癌、胃癌等领域相继发现相关异常表达的miRNA及其靶基因[4-6]。有研究表明，一些miRNA在胰腺癌中同样存在异常表达[7]，但目前为止尚未明确发现其相应的靶基因以及如何影响胰腺癌的发生发展。miR-181a是人类细胞中存在较为广泛的一类miRNA，对维持胸腺细胞分化状态发挥着关键作用[8-9]。胰腺癌miRNA表达谱研究显示，miR-181a在胰腺癌组织中呈现显著高表达，提示miR-181a可能参与调控胰腺癌细胞的增殖凋亡[10]。miRNA数据库靶基因预测提示ADP核糖基化辅助因子(collaborator of ADP-ribosylation factor，CARF)基因是miR-181a可能的作用靶点，该基因可通过多条途径发挥上调p53的作用，而p53通路是胰腺癌发病机制的重要组成部分[11-12]。本研究观察miR-181a与CARF基因的相互作用，探讨两者之间是否存靶向关系及其在胰腺癌的发生发展中的作用。

    1 材料和方法

    1.1 材料 胰腺癌细胞株(Panc I)、正常胰腺细胞株(CCC-HPE-2)由浙江大学医学院肝胆胰外科重点实验室惠赠；胰腺癌及正常胰腺组织标本均取自于温州医科大学附属第一医院肝胆胰外科临床手术切除标本；双荧光素酶报告基因系统(Dual-LuciferaseReporter Assay System)，包括质粒pGL-3/Control、pRL-TK，各种内切酶及连接酶，脂质体转染试剂盒等均购自美国Promega公司。细胞培养基及相关试剂：DMEM培养基、胎牛血清、RPMI1640培养基、100×青链霉素(双抗)溶液等均购自美国Gibico公司。MTT试剂盒购自美国Sigma公司。DNA纯化试剂盒和质粒抽提试剂盒购自美国Qiagen公司，PCR相关引物合成和基因测序均委托上海生工公司协助完成。miR-181a拮抗剂(miR-181a inhibitor)和激动剂(hsa-miR-181a)及空白对照(miRNA Neg-tive Control)委托上海吉玛制药技术有限公司合成。本研究经过本院伦理委员会审核批准。

    1.2 方法

    1.2.1 miRNA的提取及miRNA-181a的定量检测：采用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit提取正常胰腺细胞株CCC-HPE-2和胰腺癌细胞株Panc I(各8个样本) ......