蒋臻，章水均，徐跻峰，赵小波，鲍涛

    (1.淳安县第一人民医院 骨科，浙江 杭州 311700；2.浙江省人民医院 骨科，浙江 杭州 310014)

    骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤之一，好发于青年患者[1]。目前，化疗及放疗依然是骨肉瘤的主要治疗手段[2]。尽管研究人员在骨肉瘤治疗领域进行大量探索并取得一定进展，骨肉瘤患者的总体预后依然较差，尤其是已经发生远处转移或复发的患者。微小RNA(microRNA，miRNA)是细胞内长度约20个核苷酸的非编码RNA，通过与靶基因mRNA的3’-端非编码区结合，在转录后水平抑制靶基因的表达[3]。 近年来，miRNA在骨肉瘤发生发展中的作用逐渐被重视。研究表明：多种miRNA在骨肉瘤中存在异常表 达，并且对骨肉瘤细胞的生长、转移及耐药性等生物学功能具有重要调控作用[4]。miR-132被发现在肝癌、肺癌及胃癌等多种恶性肿瘤中存在低表达，能够抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡，发挥抑癌作用[5-7]。骨肉瘤相关研究表明：miR-132在骨肉瘤组织中低表达，并且与骨肉瘤患者的不良预后具有相关性[8]。miR-132能够通过靶向调控cyclin E1及SXO4基因的表达，发挥对骨肉瘤细胞增殖及转移的调控作用[9-10]。然而，miR-132调控骨肉瘤细胞的侵袭转移是否存在其他分子机制，目前仍不明确。本研究通过Transwell、实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)以及Western blot实验探明miR-132对骨肉瘤细胞迁移、侵袭能力以及上皮间质转化的影响，并利用生物信息学数据库寻找miR-132的下游作用靶点，进一步利用qRT-PCR、Western blot及荧光素酶报告基因实验证实在骨肉瘤细胞中miR-132对下游靶基因表达的调控作用。

    1 材料和方法

    1.1 材料 骨肉瘤细胞系(HOS及U2OS细胞)及人成骨细胞系hFOB1.19购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。DMEM培养基及胎牛血清购自美国Gibico公司；引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司；miR-132模拟物(miR-132 mimic)和空白对照miRNA(miRNA control，miR-Control)、miR-132抑制物(miR-132 inhibitor)和阴性对照miRNA(miRNA negative control，miR-NC)、野生型HMGA2 3’-UTR质粒和突变型HMGA2 3’-UTR质粒购自上海市吉凯生物科技有限公司；转染试剂Lipofectamine 2 000、qRT-PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司；Transwell小室及24孔细胞培养板购自美国Corning公司；兔抗E-cadherin抗体、鼠抗Vimentin抗体、鼠抗HMGA2抗体、鼠抗GAPDH抗体以及HRP标记的抗鼠/兔二抗购自美国Abcam公司 ......