俞海涛，郭鹏毅，谢孝宰，陈钢

    (1.嘉兴学院附属第二医院 肝胆外科，浙江 嘉兴 314000；2.宁波市鄞州区第二医院 心胸外科，浙江宁波 315000；3.温州医科大学附属第一医院 肝胆外科，浙江 温州 325015)

    内皮祖细胞能特异性地靶向肿瘤新生血管并参与血管生成，因此以内皮祖细胞为载体和靶点的抗血管生成治疗有着诱人的应用前景，然而由于内皮祖细胞中治疗基因表达的不受调控会导致治疗失败，因此能否精确调控治疗基因定时、定量表达是取得突破的关键。前期实验将Tet-on基因表达系统调节质粒及EphA1小干扰RNA质粒成功转染进大鼠骨髓起源内皮祖细胞系中并构建了可精确调控EphA1基因表达的双稳转内皮祖细胞系EPCsEphA1/SiRNA-Tet，并证实利用强力霉素可精确诱导内皮祖细胞中EphA1 SiRNA质粒表达，从而导致EphA1 mRNA和蛋白表达的下调[1]。本研究进一步分析体外调控EPCsEphA1/SiRNA-Tet中EphA1基因的表达对EphA1/EphrinA1 信号通路以及对其细胞生物学行为的影响；同时探讨体外诱导活体内EPCsEphA1/SiRNA-Tet中EphA1基因表达对其促肝癌血管生成的影响，旨在通过本研究建立一种安全、高效的可以调控基因表达的内皮祖细胞为载体和靶点的肝癌抗血管生成治疗模式。

    1 材料和方法

    1.1 细胞系与裸鼠 6～8 周龄雄性BALB/c裸鼠购自上海实验研究动物中心，饲养于温州医科大学实验动物中心，实验动物许可证号为SYXK(浙)2015-0009。huh7 肝癌细胞株(本实验室保存)，内皮祖细胞系本实验室构建。

    1.2 试剂与材料 EphA1、EphrinA1多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)、CD31单克隆抗体(英国Abcam公司)，MTT(美国Sigma公司)，Matrigel胶(美国R&D公司)，Transwell小室(美国Corning公司)，EGM-2含生长因子培养基(瑞士LONZA公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)。

    1.3 Western blot检测强力霉素对EphA1/EphrinA1信号通路影响 检测强力霉素对EPCsTet-On-EphA1SiRNA中EphA1及其配体EphrinA1蛋白表达的影响：分为调控组[Dox(+)组，培养液中分别含强力霉素1 μg/mL、10 μg/mL和100 μg/mL]及非调控组[Dox(-)组]。简要步骤：收获对数生长期的细胞约2×105个，加100 μL细胞裂解液混匀后 ......