曹佳欣，程琳妍，刘淑贤，谭峰

    (温州医科大学，浙江 温州 325035，1.眼视光学院 生物医学工程学院；2.第一临床医学院；3.基础医学院)

    刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种机会性致病原虫，可寄生于人和哺乳动物、鸟类、爬行类等动物的有核细胞内。据评估，全球约1/3人口血清弓形虫抗体呈阳性[1]，所致的弓形虫病是一种重要的人畜共患疾病。当宿主免疫力下降时，弓形虫常可引起弓形虫脑炎、弓形虫眼病等，严重时可致死亡[2]。寻找合适的弓形虫防治药物靶点对于弓形虫病的防治具有重要意义。

    顶质体是大多数顶复门寄生虫(包括弓形虫)中一个独特的、叶绿体样细胞器，对于虫体发育具有极其重要的作用，能够为虫体脂肪酸、类异戊二烯和血红素等生物合成提供重要场所[3]。由于顶质体不存在于其他哺乳动物细胞中，因而被认为是特异性抑制或杀灭弓形虫的理想靶点[4]。与其他质体相似，绝大多数顶质体蛋白为核编码蛋白[5-6]，分别为包含有经典的靶向肽序列蛋白和缺失经典的靶向肽序列蛋白[7]。弓形虫顶质体基质蛋白Cpn60蛋白(TgCpn60)属于前者。

    Cpn60为第I类伴侣蛋白，因其大小为60 kDa，一般称为Chaperonin60。目前已经发现的有两类伴侣蛋白，第I类伴侣蛋白最常见，广泛存在于原核和真核生物中的寡聚蛋白复合体，如存在于细菌(GroEL)、 质体(Cpn60)和线粒体(Hsp60)。细菌伴侣蛋白[8-9]和线粒体伴侣蛋白[10-11]已有较深入的研究，在高等植物中，Cpn60被证实具有帮助蛋白完成折叠装配的功能[12]。而在顶复门寄生虫中，Cpn60的生物学功能及作用机制尚未明确。据此，我们在弓形虫数据库ToxoDB中找到弓形虫伴侣蛋白TgCpn60的编码基因，通过原核表达TgCpn60蛋白，制备其特异性多克隆抗体，为研究该蛋白生物学功能、观察顶质体内稳态提供实验材料。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株、质粒、虫株及实验动物：原核表达载体pGEX-4T-1、大肠埃希菌(E.coli)TOP10和BL21感受态细胞、人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts，HFF)、弓形虫RH株速殖子均为本实验室保存。pFNR-RFP质粒为法国国家科学研究中心Sébastien Besteiro教授馈赠。BALB/c小鼠购自温州医科大学实验动物中心，实验动物许可证号：SYXK(浙)2015-0009。

    1.1.2 PCR引物设计与合成：①巢式PCR引物：根据ToxoDB中TgCpn60基因编码序列(TGGT1_ 240600) ......