汪艳，金琼，陈威，黄慧

    1.温州医科大学附属口腔医院 种植科，浙江 温州 325027；2.温州医科大学附属口腔医院 儿童口腔科，浙江 温州 325027；3.上海交通大学医学院附属第九人民医院 修复科，上海 200011

    微小RNA(microRNA，miRNA)是小的内源性RNA，可在转录后调节基因表达[1]。本课题组在前期对成骨调控的研究过程中发现miRNA参与釉基质蛋白诱导小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1细胞成骨分化过程，挑选出了一系列发生显著表达异常的miRNAs。其中miR-30家族成员miR-30a、miR-30b、miR-30c和miR-30d在成骨分化过程中显著下调，同时这些家族成员的抑制剂则可以促进成骨分化[2]。有学者发现miR-30家族成员可恢复骨吸收与骨生成间的平衡[3]。由于miRNA动物实验的体内环境复杂、实验周期较长，对miRNA产品的稳定性提出了更高的要求，本研究将采用稳定性更好、可靠性更高的化学修饰miRNA antagomir进行体外实验，在细胞水平进行miR-30d拮抗剂(antagomir-30d)及其阴性对照(NC)的转染实验，验证antagomir-30d在细胞水平对成骨分化的调控作用，并通过转染不同浓度后成骨基因表达水平确定其最佳转染浓度。

    1 材料和方法

    1.1 材料 4周龄SPF级Wistar雄性大鼠由上海交通大学医学院附属第九人民医院动物实验中心提供。α-MEM培养基购自美国Invitrogen公司，DME培养基购自美国Gibco公司，SYBR?PrimeScript?RTPCR Kit购自日本Takara公司，RNAse Free Water购自美国Ambion公司，引物购自上海生工生物技术有限公司，cDNA合成试剂购自日本Takara公司，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

    1.2 方法

    1.2.1 大鼠骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)的获取和培养方法：大鼠脱臼处死，置于75%乙醇中浸泡消毒10 min，无菌条件下取其胫骨和股骨，剔除周围附着肌肉，将其两端干骺端剪除，显露骨髓腔。10 mL无菌注射器吸取含有肝素(200 U/mL)和10% FBS的α-MEM培养液反复冲洗骨髓腔至由红色变白色。细胞悬液以1 800 r/min的转速离心10 min，弃上清液，并加入标准培养液10 mL，用滴管轻轻吹散细胞团后接种于10 cm培养皿 ......